一、MAGeCK概要

MAGeCK是一種基于模型的全基因組 CRISPR-Cas9 敲除的分析計(jì)算工具，可從最近的基因組規(guī)模 CRISPR-Cas9 敲除篩選 (或 GeCKO) 技術(shù)中識(shí)別重要基因。由 Dana-Farber 癌癥研究所劉曉樂博士實(shí)驗(yàn)室的 Wei Li 和 Han Xu 開發(fā)，并由國家兒童醫(yī)學(xué)中心的 Wei Li 實(shí)驗(yàn)室積極更新。

二、MAGeCKFlute的主要功能

三、流程摘要

1、使用 MAGeCK 和 MAGeCK-VISPR 進(jìn)行 CRISPR 篩選數(shù)據(jù)分析的基礎(chǔ)知識(shí)

MAGeCKFlute 分別使用 mageck count 和 mageck test/mle 執(zhí)行讀取映射和命中識(shí)別，這是 MAGeCK 和 MAGeCK-VISPR 的主要功能（表 1）。MAGeCKFlute 的典型輸入是 FASTQ 文件或原始read-count表，其中列是樣本，行是 sgRNA。CRISPR 篩選分析通常包含兩個(gè)部分：sgRNA 水平和基因水平分析。sgRNA水平分析模型獨(dú)立讀取單個(gè) sgRNA 的計(jì)數(shù)，計(jì)算每個(gè)sgRNA的倍數(shù)變化和P值，類似于RNA-seq分析。基因水平分析整合了 sgRNA 水平倍數(shù)變化和 P 值，以識(shí)別感興趣的基因hits。MAGeCK 首先將測(cè)序讀數(shù)比對(duì)到 sgRNA 文庫，然后標(biāo)準(zhǔn)化 sgRNA 讀數(shù)計(jì)數(shù)以調(diào)整測(cè)序深度。

2、質(zhì)量控制和read-count表生成

在識(shí)別hits之前，需要將reads與已知的 sgRNA 庫對(duì)齊并評(píng)估篩選質(zhì)量（圖 2）。MAGeCK 和 MAGeCK-VISPR 將reads與 sgRNA 文庫文件比對(duì)，計(jì)算每個(gè) sgRNA 的read數(shù)量并輸出一組 QC 統(tǒng)計(jì)信息，包括以下內(nèi)容。

● 比對(duì)到的reads數(shù)量（圖 2a）；

● 比對(duì)到的reads的百分比（圖 2a）；

● 樣本之間的read count相關(guān)性（圖2b）；

● Gini 指數(shù)（衡量 sgRNA read count的均勻性）（圖 2c）；

● 比對(duì)到0個(gè)reads的 sgRNA 的數(shù)量（圖 2d）。

比對(duì)read百分比過低可能意味著存在寡核苷酸合成錯(cuò)誤、測(cè)序錯(cuò)誤或受污染的樣品。高比對(duì)率則表明樣品制備和測(cè)序成功。缺失sgRNA 量少也是高質(zhì)量樣本的良好指標(biāo)。MAGeCK 和 MAGeCK-VISPR 使用基尼指數(shù)（這是經(jīng)濟(jì)學(xué)上衡量美國收入不平等的常用指標(biāo)。）來衡量 sgRNA 讀取計(jì)數(shù)的均勻性。高 Gini 指數(shù)表明 sgRNA read count在目標(biāo)基因中分布不均勻。這可能是由 CRISPR 寡核苷酸合成的不均勻性、低質(zhì)量的病毒文庫包裝、病毒轉(zhuǎn)染效率低下或篩選過程中的過度選擇引起的。

3、去除批次效應(yīng)

在多個(gè)批次中執(zhí)行或排序的 CRISPR 篩選可能包含批次效應(yīng)。如果 CRISPR 篩選數(shù)據(jù)是使用不同的試劑或測(cè)序平臺(tái)、在不同的時(shí)間或在實(shí)驗(yàn)條件的任何其他意外變化下生成的，則可以在這些數(shù)據(jù)中觀察到批次效應(yīng)。在這種情況下，去除批次效應(yīng)是數(shù)據(jù)分析的必要步驟。一個(gè)例子是結(jié)腸癌中的公共數(shù)據(jù)庫CRISPR 篩選，它具有很強(qiáng)的批次效應(yīng)，其中樣品按批次而不是按條件聚類（圖 3a）。使用 ComBat 函數(shù)（合并到 MAGeCKFlute 中）在 sgRNA 計(jì)數(shù)級(jí)別校正數(shù)據(jù)集中的批次效應(yīng)后，生物重復(fù)正確地聚集在一起（圖 3b），這表明批次效應(yīng)已被移除。

4、識(shí)別CRISPR 篩選hits

用于識(shí)別基因hits的第一種方法是 MAGeCK RRA。MAGeCK RRA 允許比較兩個(gè)實(shí)驗(yàn)條件。它可以識(shí)別在兩種條件下基本上選擇的 sgRNA 和相應(yīng)的基因。MAGeCK RRA 根據(jù)從負(fù)二項(xiàng)式模型計(jì)算出的 P 值對(duì) sgRNA 進(jìn)行排序，并使用名為 α-RRA 的修改后的 RRA 算法來識(shí)別正選擇或負(fù)選擇的基因。MAGeCK RRA 使用 RRA 富集分?jǐn)?shù)來指示基因的重要性。可以模擬復(fù)雜實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的另一種方法是 MAGeCK MLE，它可用于分析來自具有多種試驗(yàn)條件的篩選數(shù)據(jù)，例如包含至少三個(gè)條件的典型藥物篩選：第 0 天條件、對(duì)照條件（用媒介，如 DMSO）和藥物治療的條件。MAGeCK MLE 還模擬了 sgRNA 敲除效率，這可能因不同的序列內(nèi)容和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)而異。MAGeCK MLE計(jì)算每個(gè)目標(biāo)基因的“beta score”，以測(cè)量基因擾動(dòng)時(shí)的選擇程度，類似于差異表達(dá)分析中的“對(duì)數(shù)倍數(shù)變化”測(cè)量。

MAGeCK-VISPR 進(jìn)一步整合了 MAGeCK 的所有功能，并使用基于 Web 的交互式框架 VISPR 對(duì)所有結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制和可視化。MAGeCK NEST 為 MAGeCK-VISPR 添加了功能以改進(jìn)hit calling。首先，MAGeCK NEST 可以使用網(wǎng)絡(luò)重要性評(píng)分工具 (NEST) 來整合來自蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的信息，從而改善結(jié)果。其次，MAGeCK NEST 采用最大似然法去除 sgRNA 異常值，這些異常值通常具有更高的 G 核苷酸計(jì)數(shù)。如果有很多 sgRNA 異常值或如果在篩選數(shù)據(jù)中觀察到高 Gini 指數(shù)，用戶應(yīng)該考慮使用 MAGeCK NEST 來改進(jìn)hit calling。

5、使用陰性對(duì)照序列或非必需基因進(jìn)行讀數(shù)歸一化

通常需要在單個(gè)實(shí)驗(yàn)中比較不同條件之間的read-counts。為了在不同生長條件之間進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，理想的標(biāo)準(zhǔn)是靶向所有起始細(xì)胞群中完全惰性的基因組位置的sgRNA，這樣在任何實(shí)驗(yàn)條件下細(xì)胞增殖都不會(huì)受到不同的影響。AAVS1 是一個(gè)經(jīng)過充分驗(yàn)證的基因座，可用于承載外源基因序列。它具有開放的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)并且具有轉(zhuǎn)錄能力。最重要的是，插入或刪除 AAVS1 基因座 sgRNA 對(duì)細(xì)胞沒有已知的不利影響，靶向 AAVS1 的 sgRNA 在樣本中具有相似的行為（圖 3c），表明靶向 AAVS1 的 sgRNA 可能是讀取計(jì)數(shù)的合適對(duì)照正常化。使用 AAVS1 靶向 sgRNA 作為對(duì)照還可以減輕 Cas9 的核酸酶誘導(dǎo)的毒性并降低整體假陽性率。

與靶向 AAVS1 基因座的 sgRNA 類似，靶向非必需基因的 sgRNA 也可用于標(biāo)準(zhǔn)化讀取計(jì)數(shù)。如果 AAVS1 靶向 sgRNA 不可用，我們編制了一份非必需基因列表（補(bǔ)充數(shù)據(jù) 1），用于 CRISPR 篩選的標(biāo)準(zhǔn)化。從 927 個(gè)在多個(gè) CRISPR 篩選中沒有實(shí)質(zhì)性影響的非必需基因開始，我們刪除了在多個(gè)細(xì)胞系中低水平表達(dá)的基因。我們?cè)诎┘?xì)胞系百科全書（CCLE）細(xì)胞系（補(bǔ)充圖 1b）的 98.3%（1,036 個(gè)中的 1,019 個(gè)）中選擇了表達(dá)在第 5-100 個(gè)百分位（補(bǔ)充圖 1a）中的基因。937 個(gè)非必需基因中有 350 個(gè)通過了這些標(biāo)準(zhǔn)（補(bǔ)充圖 1）。這 350 個(gè)基因的表達(dá)分布在數(shù)百種癌細(xì)胞系中是一致的（補(bǔ)充數(shù)據(jù) 1）。這表明靶向這些基因的 sgRNA 是 CRISPR 篩選標(biāo)準(zhǔn)化的合適對(duì)照，如果靶向 AAVS1 的 sgRNA 不可用（圖 3d）。MAGeCKFlute 還支持使用非必需基因列表中的 sgRNA 進(jìn)行讀取標(biāo)準(zhǔn)化，我們建議至少包括庫中的 200 個(gè)非必需基因以確保有效的標(biāo)準(zhǔn)化。

6、拷貝數(shù)偏差校正

在 CRISPR 篩選中，在目標(biāo)基因組位點(diǎn)誘導(dǎo)雙鏈斷裂的過程會(huì)觸發(fā) DNA 損傷反應(yīng)機(jī)制，并可能導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯，尤其是在具有高拷貝數(shù)區(qū)域的細(xì)胞中。當(dāng)擴(kuò)增區(qū)域包含目標(biāo)非必需基因時(shí)，觀察到的 beta 分?jǐn)?shù)通常比預(yù)期的更負(fù)面（補(bǔ)充圖 2a）。β 分?jǐn)?shù)為負(fù)表示敲除該基因可能會(huì)抑制細(xì)胞增殖或?qū)е录?xì)胞死亡，從而在基本基因鑒定中引入了假陽性。如果用戶提供了相應(yīng)的拷貝數(shù)文件（示例數(shù)據(jù)的相應(yīng)拷貝數(shù)文件作為補(bǔ)充數(shù)據(jù)提供），我們將在protocol中提出一種可選方法（步驟 7A(viii)）來糾正與拷貝數(shù)相關(guān)的偏差2）。在這種方法中，基因組拷貝數(shù)和觀察到的必要性之間的關(guān)系是針對(duì)每個(gè)實(shí)驗(yàn)中的每個(gè)基因進(jìn)行定量建模的。然后根據(jù)觀察到的結(jié)果調(diào)整拷貝數(shù)偏差，為所有受影響的基因生成校正的 beta 分?jǐn)?shù)。該功能已被整合到 MAGeCKFlute 流程中，可以在執(zhí)行 MAGeCK RRA 或 MLE 時(shí)應(yīng)用。

7、使用必需基因進(jìn)行 Beta 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)化

暴露于不同條件（有或沒有藥物治療）的細(xì)胞可能具有不同的增殖率。例如，CDK4/6 抑制劑會(huì)影響細(xì)胞周期并通常會(huì)降低細(xì)胞增殖。因此，將倍增時(shí)間較快的細(xì)胞與增殖較慢的細(xì)胞進(jìn)行比較可能會(huì)導(dǎo)致hit 識(shí)別的偏差，因?yàn)榛蛩坪踉谠鲋齿^快的細(xì)胞群中具有更強(qiáng)的選擇性。在比較使用和未使用藥物處理的樣品時(shí)，通常會(huì)出現(xiàn)這種情況，因?yàn)樵S多藥物會(huì)影響細(xì)胞增殖。每個(gè)基因的“beta 分?jǐn)?shù)”表示基因正在經(jīng)歷的選擇類型：正 beta 分?jǐn)?shù)表示正選擇，負(fù) beta 分?jǐn)?shù)表示負(fù)選擇。當(dāng)不同樣品在CRISPR篩選中同時(shí)培養(yǎng)時(shí)，倍增時(shí)間越短的細(xì)胞選擇周期越多；因此，快速生長細(xì)胞中的基因往往會(huì)產(chǎn)生更高的絕對(duì) β 分?jǐn)?shù)（補(bǔ)充圖 3a）。為了矯正這種偏差，我們生成了一個(gè)包含 625 個(gè)精選的、高可信度的核心必需基因的列表（補(bǔ)充數(shù)據(jù) 3），可用于標(biāo)準(zhǔn)化 beta 分?jǐn)?shù)（有關(guān)詳細(xì)信息，請(qǐng)參閱補(bǔ)充方法）。MAGeCKFlute 使用核心必需基因列表（步驟 11B）對(duì)基因 beta 評(píng)分進(jìn)行歸一化，假設(shè)它們?cè)趦蓚€(gè)樣本之間同樣負(fù)選擇，即使兩個(gè)樣本具有不同的基線增殖率。所有基因的 beta 分?jǐn)?shù)都根據(jù)這組精制的 625 個(gè)必需基因的中值 beta 分?jǐn)?shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。歸一化后，兩個(gè)樣本的回歸線的斜率和 x 截距分別接近 1 和 0，這表明在全基因組篩選中對(duì)必需基因進(jìn)行歸一化使樣本之間的 beta 分?jǐn)?shù)具有可比性（補(bǔ)充圖 3b）。對(duì)于經(jīng)過某種處理的 CRISPR 篩選，我們建議用戶對(duì)必需基因進(jìn)行歸一化，以使處理和對(duì)照樣本之間的 beta 分?jǐn)?shù)具有可比性。?

8、細(xì)胞處理后的差異hits識(shí)別

在使用必需基因進(jìn)行 Beta 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)化后，下一步是通過減去它們的 Beta 評(píng)分來確定治療和對(duì)照條件之間的差異hits。此差異 Beta 分?jǐn)?shù)用于識(shí)別與治療相關(guān)的篩選hits。可以在 FluteMLE 函數(shù)中指定截止值，默認(rèn)值為微分 Beta 分?jǐn)?shù)的平均值1 s.d.。我們采用了“分位數(shù)匹配”方法來穩(wěn)健地估計(jì) σ，它是 beta 分?jǐn)?shù) β 的標(biāo)準(zhǔn)差。選擇 σ 使得 β 的絕對(duì)值的 (1 ? p) 經(jīng)驗(yàn)分位數(shù)與先驗(yàn)正態(tài)分布 N(0,σ 2) 的 (1 ? p/2) 理論分位數(shù)相匹配，其中 p 代表β 分?jǐn)?shù)的分位數(shù)。當(dāng)截止值為 1 sd時(shí)，p 設(shè)置為 0.32， 當(dāng)截止值為 2sd時(shí)，p設(shè)置為0.05，分別對(duì)應(yīng) 68% 和 95% 的 beta 分?jǐn)?shù)落在平均值的 1 和 2 sd 內(nèi)。如果我們將正態(tài)分布的理論上分位數(shù)寫為 Q N (1 ? p)，將 β 的經(jīng)驗(yàn)上分位數(shù)寫為 Q |β| (1 ? p)，那么 σ 計(jì)算公式為：

9、篩選hit genes的功能分析

篩選hits的功能分析提供有關(guān)在篩選設(shè)計(jì)中查詢的細(xì)胞系統(tǒng)生物學(xué)的信息。目前廣泛使用的功能分析包括 GO 富集分析和 GSEA 分析。正如預(yù)期的那樣，在簡(jiǎn)單的增殖篩選中，管家途徑的核心成分（例如，核糖體和剪接體）通常被負(fù)面選擇，并且已發(fā)現(xiàn)預(yù)測(cè)為細(xì)胞類型特異性的途徑的成分在預(yù)測(cè)的細(xì)胞類型中是必不可少的。

MAGeCKFlute 包含多個(gè)功能模塊，可用于探索篩選hits的生物學(xué)功能。我們包含了從 clusterProfiler、GOstats 和 GSEA 包派生的已發(fā)布的富集函數(shù)，并添加了富集HGT 以測(cè)試基于超幾何分布的分子特征的富集。這些功能允許用戶指定由 GO 術(shù)語、KEGG 通路、MSigDB 基因集集合或用戶定義的基因集注釋的基因的大小，然后測(cè)試它們?cè)诤Y選hits中的統(tǒng)計(jì)過度表現(xiàn)。在某些情況下，用戶可能對(duì)具有少量基因的蛋白質(zhì)復(fù)合物或通路的強(qiáng)選擇感興趣，因此限制基因集的大小將允許檢測(cè)到這種富集，而不是被弱選擇的大量通路所淹沒。