這次分享關(guān)于南京醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)外科團(tuán)隊(duì)在NEURO-ONCOLOGY雜志上發(fā)表一篇題為“EIF4A3-induced circular RNA ASAP1(circASAP1) promotes tumorigenesis and temozolomide resistance of glioblastoma via NRAS/MEK1/ERK1/2 signaling”的文章，研究發(fā)現(xiàn)真核起始因子eIF4A3誘導(dǎo)的circASAP1通過sponge miR-502-5，上調(diào)NRAS表達(dá)水平，通過MEK1/ERK1/2信號通路調(diào)節(jié)多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤GBM的增殖，從而促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的腫瘤形成。

案例文章

IF：10.247

膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性腦腫瘤，其中一半以上是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，也稱為多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最惡性的腫瘤。盡管經(jīng)過最大限度的診斷治療后，患者存活期還是不會超過15個月。有研究表明烷基化藥物替莫唑胺（temozolomide，TMZ）是治療多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）的國際標(biāo)準(zhǔn)化療藥物。目前還發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)一些非編碼RNA也能對原發(fā)性腦腫瘤起到一定的抑制作用。本研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)通過用TMZ對多形性膠質(zhì)母細(xì)胞處理后，發(fā)現(xiàn)circular RNA ASAP1(circASAP1)高表達(dá)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)是EIF4A3誘導(dǎo)的環(huán)狀RNA ASAP1（circASAP1）是通過NRAS/MEK1/ERK1/2信號促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的腫瘤發(fā)生和替莫唑胺耐藥。

結(jié)果

? circASAP1在TMZ處理過的GBM細(xì)胞和組織中高表達(dá)

收集3對均用替莫唑胺治療過的原發(fā)性和復(fù)發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者組織標(biāo)本進(jìn)行RNA-seq，生信分析結(jié)果表明兩組樣本中有相同的33種circRNA上調(diào)，23種circRNA下調(diào)，通過比較發(fā)現(xiàn)circASP1在復(fù)發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者組織高表達(dá)。作者還通過培養(yǎng)2株耐TMZ的GBM原代細(xì)胞系和2株對TMZ不敏感的原代細(xì)胞系分析circASP1的表達(dá)量與TMZ有直接的關(guān)系，分析circASP1核酸結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)引物，運(yùn)用普通PCR和qPCR技術(shù)對耐TMZ GBM細(xì)胞中circASP1定性、定量研究，確定了在耐TMZ的GBM細(xì)胞系和組織中，circASP1表達(dá)量顯著上調(diào)。

? circASP1對GBM細(xì)胞增殖以及細(xì)胞耐TMZ的影響

q-PCR、CKK-8檢測法檢和克隆形成實(shí)驗(yàn)測各組過表達(dá)circRNA的轉(zhuǎn)染效率，篩選出兩組過表達(dá)circRNA（sh-circASP1-2、sh-circASP1-3）作為TUNNEL法測細(xì)胞凋亡和用WB法檢測各組細(xì)胞凋亡標(biāo)志物的蛋白水平。結(jié)果表明敲低circASP1在細(xì)胞中的表達(dá)水平能抑制細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡以及耐TMZ低下。

? EIF4A3促進(jìn)circASP1的表達(dá)

通過circinteractome數(shù)據(jù)庫，作者發(fā)現(xiàn)circASP1 mRNA上游存在四個eIF4A3結(jié)合位點(diǎn)；RIP實(shí)驗(yàn)證明eIF4A3可以結(jié)合下游b，c和d部分的序列，但不結(jié)合circASP1和上游a的序列；體外構(gòu)建含有eIF4A3結(jié)合位點(diǎn)的RNA轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行pull-down實(shí)驗(yàn)，證明越多的eIF4A3結(jié)合位點(diǎn)，越有利eIF4A3和circASP1 mRNA的結(jié)合。通過敲低eIF4A3表達(dá)明顯抑制circASP1的表達(dá)，而過表達(dá)eIF4A3明顯促進(jìn)circASP1的表達(dá)，表明了eIF4A3能結(jié)合circASP1 mRNA下游序列，促進(jìn)8和12號外顯子的環(huán)化，從而使circASP1的表達(dá)增加。

? miR-502-5p海綿吸附CircASAP1?

FISH分析發(fā)現(xiàn)，circASP1主要分布在胞漿之中，故作者猜測其在GBM中發(fā)揮作為miRNAsponge的作用，接著利用生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，只有miR-502-5p含有circASP1的結(jié)合位點(diǎn)；雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證明，miR-502-5p與circASP1存在相互結(jié)合作用；RT-qPCR和TUNNEL實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，circASP1是通過miR-502-5p調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。

? miR-502-5p靶向調(diào)控NRAS

結(jié)合對GBM組織的RNA-seq和pudmed上已報(bào)道的miR-502-5p靶向基因分析，挖掘到miR-502-5p的一個靶向基因是NRAS；雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證明，miR-502-5p與NRAS存在相互結(jié)合作用；在rescue實(shí)驗(yàn)中，WB結(jié)果證明circASP1通過miR-502-5p上調(diào)NRAS的表達(dá)。

? CircASAP1 通過NRAS/MEK1/ERK1/2 促進(jìn)腫瘤增殖和TMZ耐藥

克隆形成實(shí)驗(yàn)證明敲低NRAS明顯抑制GBM細(xì)胞的增殖和降低其耐TMZ性，但同時給予過表達(dá)circASP1可以逆轉(zhuǎn)該抑制效果。通過WB的方法對同時轉(zhuǎn)染過表達(dá)circASP1和給予miR-502-5p抑制劑檢測MEK1/ERK1/2信號中相關(guān)蛋白的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果表明，circASP1的過表達(dá)促進(jìn)MEK1/ERK1/2信號通路的激活對細(xì)胞的增殖以及耐TMZ性起到調(diào)控作用。作者還發(fā)現(xiàn)過表達(dá)circASP1的GBM細(xì)胞在小鼠體內(nèi)成瘤能力明顯增強(qiáng)，但敲低circASP1過表達(dá)的同時給藥TMZ能抑制成瘤能力，也能夠提高小鼠的存活率。

總結(jié)

本研究說明了circASAP1在替莫唑胺耐藥中起重要作用，是預(yù)測患者預(yù)后和進(jìn)行治療干預(yù)的潛在靶點(diǎn)，有助于我們對GBMs發(fā)病機(jī)制的理解以及為提供治療GBMs的技術(shù)手段提供一定的理論知識。

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