miRNA研究思路

一．技術(shù)路線

二．研究?jī)?nèi)容

第一步 確定差異miRNA表達(dá)

? ? ? ? 利用 RT-PCR 或者 RT-qPCR 檢測(cè) miRNA 在不同細(xì)胞或者組織中的表達(dá)水平。

第二步miRNA的功能研究

? ? ? ?探討miRNA功能可用 gain/loss of function 策略，過表達(dá)或沉默 lncRNA 后觀察表型。即研究 lncRNA 功能獲得后或者功能缺失后對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移與克隆形成，以及病毒的轉(zhuǎn)錄復(fù)制等的影響。

? ? ? （1）功能獲得性研究

構(gòu)建 miRNA 過表達(dá)質(zhì)粒或者慢病毒、腺病毒包裝載體。原則上是將全長(zhǎng)miRNA 定向克隆到表達(dá)載體上實(shí)現(xiàn)miRNA 的過表達(dá)。

? ? ? （2）功能缺失性研究

可用 siRNA、shRNA、反義核酸、CRISPR/Cas9 等方法沉默 lncRNA，經(jīng) qRT-PCR 或 FISH 等驗(yàn)證后觀察其對(duì)疾病相關(guān)基因表達(dá)和對(duì)細(xì)胞表型等的影響。

第三步 miRNA靶基因的預(yù)測(cè)

? ? ? ?通過miRBase， targetscan，starbase等在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)可以與miRNA結(jié)合的靶基因，并通過間接實(shí)驗(yàn)和直接實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

? ? ? （1）間接實(shí)驗(yàn)：通過WB或qPCR的方法檢測(cè)miRNA過表達(dá)或抑制細(xì)胞株中靶基因的表達(dá)水平

? ? ? （2）直接實(shí)驗(yàn)：

? ? ? ?a. 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)：

? ? ? ?b. EMSA

? ? ? ?c. CHIP

第四步 挽救實(shí)驗(yàn)

? ? ? ?假如miRNA對(duì)靶基因的調(diào)控是經(jīng)典的負(fù)調(diào)控關(guān)系，miRNA過表達(dá)后會(huì)對(duì)細(xì)胞的某些功能表型產(chǎn)生影響，那么挽救實(shí)驗(yàn)就是將靶基因再過表達(dá)后看下這些功能表型能否逆轉(zhuǎn)。

第五步 機(jī)制研究

? ? ? ?miRNA的作用機(jī)制類型很多，除經(jīng)典的靶向負(fù)調(diào)控靶基因外，還有以下7種類型，需根據(jù)不同的機(jī)制選擇不同的研究方法進(jìn)行研究。

? ? ?（1）miRNA的前體pri-miRNA可翻譯為多肽

? ? ?（2）miRNA可與其他功能蛋白相結(jié)合

? ? ?（3）miRNA可直接激活TLR受體蛋白（非改變表達(dá)量）

? ? ?（4）miRNA可提高蛋白表達(dá)水平

? ? ?（5）miRNA靶向調(diào)控線粒體相關(guān)基因mRNA

? ? ?（6）miRNA可直接激活基因轉(zhuǎn)錄過程

? ? ?（7）miRNA可靶向負(fù)調(diào)控其他非編碼RNA的前體RNA

第六步 體內(nèi)驗(yàn)證

? ? ? 有條件的實(shí)驗(yàn)室可以繼續(xù)通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，在體內(nèi)或者臨床樣本水平進(jìn)行驗(yàn)證。

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