1. CRISPR/cas9文庫簡介

? ? ? ? ??2013年以來，CRISPR/cas9技術(shù)憑借著成本低廉，操作方便，效率高等優(yōu)點(diǎn)，已迅速風(fēng)靡全球的實(shí)驗(yàn)室，成為了生物科研的有力幫手，是繼“鋅指核酸內(nèi)切酶（ZFN）”、“類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（TALEN）”之后出現(xiàn)得第三代“基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)”。

? ? ? ? ?CRISPR/cas9系統(tǒng)最初在大腸桿菌基因組中被發(fā)現(xiàn)，是細(xì)菌中抵抗外援病毒得免疫系統(tǒng)。CRISPR/cas9系統(tǒng)由兩部分組成，一部分是用來識(shí)別靶基因組得，長度為20bp左右得sgRNA序列，另外一部分是存在于CRISPR位點(diǎn)附近得雙鏈DNA核酸酶-Cas9，能在sgRNA得引導(dǎo)下對(duì)靶基因進(jìn)行切割，最終通過細(xì)胞內(nèi)得非同源性末端連接機(jī)制（NHEJ）和同源重組修復(fù)機(jī)制（HDR）對(duì)形成斷裂的DNA進(jìn)行修復(fù)，從而形成基因的敲除和插入，最終實(shí)現(xiàn)基因的（定向）編輯。

? ? ?與前兩代技術(shù)相比，CRISPR-Cas9技術(shù)最大的突破是不僅可以對(duì)單個(gè)基因進(jìn)行編輯，更重要的是可以同時(shí)對(duì)多個(gè)基因進(jìn)行編輯，這也為全基因組篩選提供了有效的方法。

2.?CRISPR/cas9文庫種類

1）CRISPR/cas9敲除文庫:

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2）CRISPR/cas9激活文庫:

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3）人源lncRNA激活庫

4) 定制CRISPR/cas9文庫

靶位點(diǎn)確認(rèn)及sgRNA文庫設(shè)計(jì)；

sgRNA文庫芯片合成；

sgRNA文庫構(gòu)建；

QC驗(yàn)證文庫質(zhì)量。

3. CRISPR/cas9文庫篩選流程

4.?CRISPR/cas9文庫應(yīng)用實(shí)例

1）陽性選擇，通過隨機(jī)誘變收集具有生長優(yōu)勢(shì)的群體。

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2）陰性選擇，確定特定條件下生存的必須基因，如果一個(gè)細(xì)胞攜帶了靶向生存必須基因的gRNA，那么敲除后的細(xì)胞不能存活。

3）案例展示

1.?Genome-wide CRISPR Screen in a Mouse Model of Tumor Growth and Metastasis

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采用“全基因組CRISPR敲除文庫”，經(jīng)過慢病毒庫擴(kuò)增后，病毒庫感染肺癌細(xì)胞株，經(jīng)篩選后接種到裸鼠皮下，定期觀察直至其肺部生成足量轉(zhuǎn)移灶，取肺組織并提取基因組DNA，通過PCR技術(shù)擴(kuò)增sgRNA靶序列，高通量測(cè)序獲得轉(zhuǎn)移靶基因。

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2.?A genome-scale CRISPR-Cas9 screening in myeloma cells identifies regulators of immunomodulatory drug sensitivity

? ? 利用CRISPR-Cas9技術(shù)，在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中進(jìn)行了全基因組篩選，尋找能夠進(jìn)一步提高免疫調(diào)控類藥物療效的潛在靶點(diǎn)。該文章使用的GeCKOv2文庫能針對(duì)細(xì)胞內(nèi)的19050條基因（每條基因被6條sgRNA所靶向）和1864條微RNA（每條微RNA被4條sgRNA所靶向），這能確保篩選的覆蓋率。通過如下篩選流程：CRISPR-Cas9文庫擴(kuò)增--感染MM1S細(xì)胞--使用泊馬度胺進(jìn)行藥物篩選--收取藥物篩選7d，14d，21d的實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組細(xì)胞進(jìn)行高通量測(cè)序。發(fā)現(xiàn)多發(fā)性骨髓瘤對(duì)亞胺類藥物產(chǎn)生耐藥的機(jī)制，并針對(duì)多發(fā)性骨髓瘤對(duì)提出了新的治療方案，以增強(qiáng)對(duì)亞胺類藥物的敏感性或克服耐藥性。

3.Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in gastrointestinal stromal tumor?with Imatinib resistance

? ? ?? ??伊馬替尼（格列衛(wèi)）是一種治療白血病及胃腸道間質(zhì)腫瘤的藥物，但往往產(chǎn)生耐藥，機(jī)制不明。在該研究中，研究人員利用CRISPR-Cas9全基因敲除文庫技術(shù)篩選針對(duì)胃間質(zhì)瘤的伊馬替尼耐藥的基因。

5.?CRISPR/cas9文庫應(yīng)用拓展，與新藥篩選，整體課題進(jìn)行鏈接

新藥篩選：基因與藥物

整體課題：腫瘤相關(guān)基因經(jīng)典研究方案

6.?參考文獻(xiàn)

1）Chen S, Sanjana NE, Zheng K, et al.Genome-wide CRISPR screen in a mouse model of tumor growth and metastasis.Cell. 2015 Mar 12;160(6):1246-60.

2）Liu J, Song T, Zhou W, et al.A genome-scale CRISPR-Cas9 screening in myeloma cells identifies regulators of immunomodulatory drug sensitivity.Leukemia. 2019 Jan;33(1):171-180.

3）Cao J, Wei J, Yang P, et al.Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in gastrointestinal stromal tumor with Imatinib resistance.Mol Cancer. 2018 Aug 13;17(1):121.?