? ? ? ?2013年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)授予美國(guó)科學(xué)家詹姆斯?羅思曼、蘭迪?謝克曼以及德國(guó)科學(xué)家托馬斯?祖德霍夫，以表彰他們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的囊泡運(yùn)輸調(diào)控機(jī)制。這使得外泌體相關(guān)研究成為學(xué)術(shù)界的大熱門(mén)，大批科研工作者投入到研究外泌體研究的熱潮中。

1. 外泌體簡(jiǎn)介

? ? ? 外泌體（Exosome）是一種直徑為30-100nm的納米級(jí)脂質(zhì)包裹體結(jié)構(gòu)，廣泛分布于外周血、尿液、唾液、腹水、羊水等多種體液中。其內(nèi)部包裹了蛋白、mRNA、miRNA和少量DNA等物質(zhì)，這些生物活性物質(zhì)可在細(xì)胞之間穿梭并介導(dǎo)細(xì)胞間的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)與信息交流，進(jìn)而影響細(xì)胞的生理功能。部分腫瘤中的研究發(fā)現(xiàn)，有些miRNA會(huì)通過(guò)外泌體到達(dá)其他細(xì)胞組織，調(diào)控腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥、微環(huán)境等。

2. 服務(wù)內(nèi)容

? ? ? ?1）外泌體分離提取，包括血清、細(xì)胞培養(yǎng)上清、尿液等

? ? ? ?2）外泌體鑒定，包括透射電鏡、流式細(xì)胞術(shù)、Western blot、納米顆粒示蹤等

? ? ? ?3）外泌體基因、蛋白檢測(cè)分析技術(shù)（mRNA、miRNA、lncRNA、protein等）

? ? ? ?4）細(xì)胞功能以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證外泌體的功能

? ? ? ?5）結(jié)合miRNA、lncRNA、功能蛋白等的研究方法檢測(cè)外泌體的生物學(xué)功能以及作用機(jī)制

3. 外泌體提取

? ? ? ?外泌體的提取有試劑盒法，超速離心法，超濾法，三種方法都可提取血清、血漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清的中的exosome，但不同的樣本、不同實(shí)驗(yàn)需求，需要做適當(dāng)調(diào)整。

? ? ? ?血清：若只用于芯片檢測(cè)，推薦超速離心法，需樣本0.5-1ml；若除了芯片檢測(cè)，還需用于其它實(shí)驗(yàn)，推薦試劑盒法，需樣本0.5-1ml；凍存樣本為血清。

? ? ? ?血漿：若只用于芯片檢測(cè)，推薦超速離心法，需樣本0.5-1ml；若除了芯片檢測(cè)，還需用于其它實(shí)驗(yàn)，推薦試劑盒法，需樣本0.5-1ml；凍存樣本為血清。

? ? ? ?細(xì)胞上清（FBS）：推薦超濾法，需培養(yǎng)上清150-200ml。

? ? ? ?細(xì)胞上清（FBS-free）：推薦試劑盒提法，需培養(yǎng)上清50-80ml。

? ? ? ?細(xì)胞上清（exosome-free FBS）：推薦試劑盒提法，需培養(yǎng)上清50-80ml。

4. 外泌體鑒定

? ? ? ?透射電子顯微鏡（Transmission Electron Microscope）及納米顆粒示蹤分析（Nanoparticle Tracking Analysis）確證大小，免疫印跡（Western blot）驗(yàn)證標(biāo)記蛋白CD9/CD63/CD81/HSP70。

5. 案例展示

? ? ? ?Title：Exosomal miR-1290 and miR-375 as prognostic markers in castration-resistant prostate cancer

? ? ? ?Journal：EUR UROL

? ? ? ?Impact factor：17.298

? ? ? ?目的是研究外泌體中的miRNA能否對(duì)前列腺癌患者的預(yù)后情況進(jìn)行評(píng)估，首先通過(guò)對(duì)多個(gè)前列腺患者的血漿外泌體進(jìn)行高通量測(cè)序，分析得到miR-375和miR1290有顯著的差異表達(dá)，并與前列腺癌預(yù)后有顯著關(guān)聯(lián)。然后通過(guò)QPCR的方法對(duì)高通量測(cè)序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。為前列腺癌的診斷標(biāo)志物研究提供新的論據(jù)。

技術(shù)路線

結(jié)果展示

? ? ? 1. 通過(guò)外泌體高通量測(cè)序數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)已知的microRNA 375個(gè)，未知的microRNA 57個(gè)；選擇穩(wěn)定表達(dá)的micorRNA-30a-5p和micorRNA-30e-5p作為定量PCR檢測(cè)驗(yàn)證的內(nèi)參。

外泌體RNA種類(lèi)及含量分布圖

2. 高通量測(cè)序分析出差異表達(dá)基因中，通過(guò)QPCR方法驗(yàn)證得到生存相關(guān)性的三個(gè)microRNA(microRNA-1290、microRNA-1268和microRNA-375)。其中microRNA-1290和microRNA-375與前列腺病人生存周期相關(guān)。通過(guò)臨床預(yù)后模型分析miR-1290和miR375，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)血漿外泌體的microRNA可作為去勢(shì)抵抗性前列腺癌病人有效預(yù)后監(jiān)測(cè)的分子標(biāo)記物。

Kaplan-Meier存活函數(shù)法預(yù)后分析

參考文獻(xiàn)

Huang X, Yuan T，et al. Exosomal miR-1290 and miR-375 as prognostic markers in castration-resistant prostate cancer.Eur Urol. 2015 Jan;67(1):33-41.

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