CRISPR文庫功能基因組篩選方案
CRISPR/Cas9系統(tǒng)是當今基因編輯領域最熱門的明星工具，2013年，Broad研究所的兩個研究團隊分別在Science雜志同一期上發(fā)表了CRISPR文庫的相關研究。在此之后，基于CRISPR/Cas9的工具得到了快速發(fā)展，CRISPRa，CRISPRi及CRISPR敲除文庫已經(jīng)廣泛用于證明新的生物學機制，如耐藥性和細胞存活信號。多篇CNS(Cell、Nature、Science)連續(xù)報道。利用該技術，研究人員在藥物靶標發(fā)現(xiàn)、基因功能研究、藥物敏感基因研究等領域取得了巨大的成功。
- 1.服務內容（以耐藥基因為例）
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1）臨床問題提出，選定合適的研究目標，確定研究癌種與目標藥物。
2）個性化設計，全基因組篩選可能與藥物發(fā)揮拮抗作用的基因。
3）高通量測序及候選基因篩選
4）候選基因功能驗證：細胞水平、動物水平，臨床相關性等
5）數(shù)據(jù)庫檢索尋找候選增敏基因的小分子抑制劑，如有可進行成藥性研究，驗證 藥物協(xié)同作用。
- 2.一般篩選流程（耐藥基因為例）
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- 3.篩選優(yōu)點
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快速準確的找到與某種表型相關的基因靶點效率高應用范圍廣開發(fā)潛力大
- 4. 現(xiàn)有CRISPR篩選文庫
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- 人源lncRNA 激活庫 ·Human CRISPR lncRNA Activation Pooled Library (SAM-3) ·靶向激活10,504個lncRNA ·包含96,458個sgRNA靶點
- 人源敲除庫 ·Human CRISPR Knockout Pooled Library (GeCKO v2)? ·?靶向敲除19,050個mRNA 及1864個miRNA ·包含123,411個sgRNA靶點
- 人源激活庫 ·Human CRISPR Activation Library (SAM-2)·靶向激活23,430個mRNA·包含70,290個sgRNA靶點
- 小鼠敲除庫 ·Mouse CRISPR Knockout Pooled Library (GeCKO v2) ·?靶向敲除20,611個mRNA 及1175個miRNA ·包含130,209個sgRNA靶點
- 小鼠激活庫 ·Mouse CRISPRa sgRNA library Caprano (P65-HSF) ·?靶向激活22,774 (Set A), 22,658 (Set B) 個mRNA ·包含134,076個sgRNA靶點
- 其他 個性化定制 CRISPR/cas9 慢病毒文庫
- 5.篩選案例
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1） 藥物靶標發(fā)現(xiàn)
Molecular Cancer（If 7.776）雜志8月份在線發(fā)表了廣州市第一人民醫(yī)院的文章，伊馬替尼（格列衛(wèi)）是一種治療白血病及胃腸道間質腫瘤的藥物，但往往產生耐藥，機制不明。在該研究中，研究人員運用CRISPR/Cas9全基因敲除文庫在胃間質瘤中篩選并驗證了9個可能參與伊馬替尼耐藥的基因，可以用于深入探討伊馬替尼耐藥的分子機制。
篩選”耐藥基因的思路
耐藥基因篩選、差異基因的通路富集分析
耐藥基因功能驗證
Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in gastrointestinal stromal tumor with Imatinib resistance. Molecular Cancer. 2018; 17(1):121-127.
2018年4月份哈佛大學研究團隊在Cell雜志發(fā)表了運用CRISPR激活文庫篩選了化療耐藥相關的lncRNAs的研究論文。阿糖胞苷(Cytarabine, Ara-C)是一種治療AML的藥物，但往往產生耐藥，機制不明。作者利用CRISPR文庫原理構建了同時篩選有功能的mRNA、lncRNA的sgRNA篩選技術，通過“隨機激活lncRNA、mRNA的轉錄表達”的方式，篩選針對AML的阿糖胞苷耐藥RNA。最后發(fā)現(xiàn)lncRNA GAS6-AS2的激活會介導耐藥的產生，并通過體內、外實驗驗證這一發(fā)現(xiàn)。
技術路線
耐藥基因篩選策略、差異基因的通路富集分析
富集lncRNA的關聯(lián)通路注釋
GAS6-AS2耐藥：體外功能驗證，預后分析
GAS6-AS2耐藥：體內驗證
An?Integrated?Genome-wide CRISPRa?Approach?to?Functionalize?lncRNAs?in?Drug Resistance. Cell.?2018; 173(3):649-664.e20.
2） 藥物靶標發(fā)現(xiàn)
自噬是一種細胞內降解過程，需要多個自噬相關（ATG）基因的參與。在這個研究中，東京國立癌癥中心研究所采用自噬流體報告基因GFP-LC3-RFP進行了全基因組CRISPR文庫篩選，并鑒定出新的ATG家族基因TMEM41B，并發(fā)現(xiàn)TMEM41B與VMP1在自噬體形成的早期階段一起發(fā)揮作用。
GFP-LC3-RFP全基因組篩選思路
TMEM41B敲除對自噬的影響
Genome-wide CRISPR screen identifies TMEM41B as a gene required for autophagosome formation. J Cell Biol.?2018; 217(11):3817-3828.
3） 肺轉移基因篩選
Cell雜志發(fā)表的張峰團隊的研究論文，該研究采用“全基因組CRISPR敲除文庫”，經(jīng)過慢病毒庫擴增后，感染肺癌細胞株，經(jīng)篩選后接種到裸鼠皮下，定期觀察直至其肺部生成足量轉移灶，取肺組織并提取基因組，PCR產物進行高通量測序獲得肺轉移相關基因，并進行實驗驗證。
篩選思路
腫瘤生長及轉移情況
原發(fā)性腫瘤基因富集分析
轉移瘤基因富集分析
單基因體內驗證
Genome-wide?CRISPR?screen?in a?mouse?model?of?tumor?growth?and?metastasis. Cell.?2015; 160(6):1246-60.
4）免疫相關基因篩選
哈佛大學醫(yī)學院Dana-Farber癌癥研究所等研究團隊通過CRISPR文庫體內篩選，鑒定出免疫相關基因Ptpn2，抑制Ptpn2可能會增強引起IFNγ反應的免疫療法的效果，Ptpn2有望作為新的免疫治療靶標。
篩選策略
體內實驗驗證篩選到靶標Ptpn2
Ptpn2缺失使腫瘤對免疫療法敏感
In vivo CRISPR screening identifies Ptpn2 as a cancer immunotherapy target. Nature.?2017; 547(7664):413-418.
- 6.其他相關文獻
1. A CRISPR screen identifies CDK7 as a therapeutic target in hepatocellular carcinoma. Cell Res. 2018.
2. Genome-wide?CRISPR?screen?for?PARKIN?regulators?reveals?transcriptionalrepression?as a?determinant?of?mitophagy. Proc Natl Acad Sci.?2018.
3. An Integrated Genome-wide?CRISPRa?Approach to?Functionalize lncRNAs in Drug Resistance.Cell.2018.
4. Defining essential genes for human pluripotent stem cells by CRISPR-Cas9 screening in haploid cells. Nat Cell Biol. 2018.
5. TRRAP is essential for regulating the accumulation of mutant and wild-type p53 in lymphoma. Blood. 2018.
6. LKB1, Salt-Inducible Kinases, and MEF2C Are Linked Dependencies in Acute Myeloid Leukemia .Mol Cell.?2018.
7. Genome-wide?CRISPR-Cas9?Screen?Identifies Leukemia-Specific Dependence on a Pre-mRNA Metabolic Pathway Regulated by DCPS. Cancer Cell.?2018.
8. CRISPR-Cas9 screen reveals a MYCN-amplified neuroblastoma dependency on EZH2. J Clin Invest. 2018.
9. Genome-scale CRISPR-Cas9 Knockout and Transcriptional Activation Screening.?Nature Protocols,?2017.
10. Genome-scale?activation?screen identifies a lncRNA locus regulating a gene neighbourhood. Nature,?2017.
11. Compact and highly active next-generation libraries for CRISPR-mediated gene repression and?activation.?Elife, 2016.
12. Functional genetic screens for enhancer elements in the human genome using CRISPR-Cas9. Nature biotechnology, 2016.
13. A genome-wide CRISPR screen in primary immune cells to dissect regulatory networks. Cell, 2015.
14. High-resolution CRISPR screens reveal fitness genes and genotype-specific cancer liabilities. Cell, 2015.
15. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science, 2015.
16. Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains. Nature biotechnology, 2015.
17. Genome-scale transcriptional activation?by an engineered CRISPR-Cas9 complex.?Nature,?2015.
18. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature, 2014.