近期，意大利的耶穌圣嬰兒童醫(yī)院的Angela Di Giannatale團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)母細(xì)胞瘤來(lái)源外泌體攜帶miR-375，遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移到骨髓創(chuàng)造有利的環(huán)境，從而促進(jìn)骨轉(zhuǎn)移，該研究結(jié)果發(fā)表于Journal of Extracellular Vesicles 。

01??案例文章

骨髓是神經(jīng)母細(xì)胞瘤（neuroblastoma ,NB）轉(zhuǎn)移的靶器官，NB侵襲骨髓的機(jī)制仍然是未知的。腫瘤微環(huán)境在腫瘤發(fā)生發(fā)展中扮演著重要作用，間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞被認(rèn)為是腫瘤間質(zhì)的組成部分。與NB患者（無(wú)骨髓轉(zhuǎn)移）相比，骨髓轉(zhuǎn)移NB患者的骨髓間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞（BM-MSCs）展現(xiàn)出較強(qiáng)的成骨分化潛能。骨髓轉(zhuǎn)移的的NB細(xì)胞分泌的外泌體高表達(dá)miR-375，促進(jìn)BM-MSCs成骨分化。臨床數(shù)據(jù)顯示，miR-375高表達(dá)與NB患者骨髓轉(zhuǎn)移相關(guān)。結(jié)果表明，外泌體miR-375在骨髓創(chuàng)造一個(gè)有利的微環(huán)境從而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。miR-375作為一個(gè)新的生物標(biāo)志物，也是NB患者發(fā)生骨髓轉(zhuǎn)移的潛在靶標(biāo)。

02??案例文章的研究?jī)?nèi)容

? NB 和 BM 轉(zhuǎn)移患者的BM-MSCs 有較強(qiáng)的成骨分化潛力

分別從12個(gè)NB患者（8個(gè)骨轉(zhuǎn)移，MBM-MSCs；4個(gè)無(wú)骨轉(zhuǎn)移，NMBM-MSCs）和7個(gè)健康人（HC-MSCs）分離MSCs。流式分別檢測(cè)MSCs標(biāo)志物（CD90,CD105, CD81, CD9 ）和NB細(xì)胞表面標(biāo)志物（GD2）均為陽(yáng)性；造血干細(xì)胞標(biāo)志物（CD34, CD45 ）和神經(jīng)元標(biāo)志物（CD56），為陰性。原代分離的3組MSCs群體倍增時(shí)間無(wú)差異。成骨分化和qPCR檢測(cè)成骨分化相關(guān)因子（RUNX2， OSTERIX，BMP2，SPP1），MBM-MSCs 有較強(qiáng)的成骨分化潛能。

? BM轉(zhuǎn)移的NB細(xì)胞來(lái)源外泌體增強(qiáng)HC-MSCs的成骨分化

分別從原代腫瘤細(xì)胞（IMR-32 and IGR-NB8 cells ）和BM轉(zhuǎn)移的NB細(xì)胞（SKNSH, SHSY5Y, SKNBe2 c,LAN-1 and IGR-N91 ）分離外泌體。IMR32 exo和SHSY5Y-derived exo分別與HC-MSCs共培養(yǎng)24h，共聚焦成像、qPCR檢測(cè)、WB檢測(cè)和成骨誘導(dǎo)表明，與IMR32 exo 組（原位腫瘤細(xì)胞）相比，SHSY5Y-derived exo組(骨轉(zhuǎn)移來(lái)源腫瘤細(xì)胞)MSCs內(nèi)化的外泌體、骨分化相關(guān)因子（RUNX2， OSTERIX，BMP2，SPP1）和鈣沉積被顯著提高；

? miR-375在BM-metastasisNB細(xì)胞來(lái)源的外泌體和MBM-MSCs中高表達(dá)

RT-qPCR分別檢測(cè)7個(gè)NB細(xì)胞（IMR-32,IGR-NB8 cells,SKNSH, SHSY5Y, SKNBe2 c,LAN-1,IGR-N91 ）來(lái)源的外泌體miRNA表達(dá)。與原代腫瘤細(xì)胞來(lái)源外泌體相比，骨轉(zhuǎn)移NB細(xì)胞來(lái)源外泌體中，miR-375, miR-365a-3p, miR-193b-3p, miR-18a-3p, miR-140-5p 表達(dá)上調(diào)；另外，在MBM-MSCs 或SHSY5Y-exosomes /HC-MSCs 共培養(yǎng)模型中，miR-375也顯著上調(diào)。

靶標(biāo)預(yù)測(cè)顯示，YAP1 和DEPTOR 可能是miR-375 的潛在靶點(diǎn)，YAP1參與Hippo 信號(hào)通路，抑制RUNX2的活性（成骨細(xì)胞成熟必須的因子）。因此，作者推測(cè)NB分泌的外泌體攜帶miR-375到骨髓通過(guò)抑制YAP1促進(jìn)成骨分化。在骨轉(zhuǎn)移來(lái)源的NB 細(xì)胞中，YAP1 的mRNA和蛋白水平顯著低于原位腫瘤細(xì)胞；不同腫瘤細(xì)胞來(lái)源的外泌體與HC-MSCs共培養(yǎng)，SH5YSY-derived exosomes 組YAP1和DEPTOR 的mRNA、蛋白水平顯著降低。在MBM, NMBM- 和HCMSCs ，YAP1 的mRNA和蛋白表達(dá)在MBM-MSCs中也顯著降低。

? MiR-375調(diào)控成骨轉(zhuǎn)化因子的表達(dá)

分別構(gòu)建了MiR-375過(guò)表達(dá)NMBM-MSC細(xì)胞，及MiR-375下調(diào)MBM-MSC 細(xì)胞。RT-qPCR結(jié)果表明，MiR-375過(guò)表達(dá)顯著下調(diào)YAP1的mRNA和蛋白水平，然而成骨標(biāo)志物SPP1 and OSTERIX 顯著上調(diào)。相反的，抑制miR-375可以上調(diào)YAP1和DEPTOR 的mRNA和蛋白表達(dá)。

? MiR-375表達(dá)與NB患者的骨疾病相關(guān)?

為了探索MiR-375與NB患者骨髓浸潤(rùn)的相關(guān)性，17個(gè)HC，7個(gè)NMBM 患者和14個(gè)MBM患者的外周血來(lái)源的外泌體被收集，Q-PCR 分別檢測(cè)患者及患者血清來(lái)源的外泌體，在MBM組，MiR-375的表達(dá)上調(diào)。隨后27個(gè)NMBM和33個(gè)MBM患者的骨髓樣本被收集， 突觸素（觀察NB細(xì)胞的侵襲）、miR-375 表達(dá)水平被評(píng)估；miR-375 不僅在NB細(xì)胞中表達(dá)也在成骨及骨髓的其他細(xì)胞中表達(dá)。miR-375 在NB患者的臨床相關(guān)性分析顯示，miR-375陽(yáng)性與NB患者發(fā)生骨轉(zhuǎn)移正相關(guān)。在SCID小鼠模型中，PKH26 標(biāo)記的外泌體可以轉(zhuǎn)移到骨髓，并且外泌體注射組miR-375表達(dá)顯著升高。

總之，本研究闡明了神經(jīng)母細(xì)胞瘤通過(guò)外泌體中的miR-375，促進(jìn)骨髓間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞的成骨分化。

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