本期為大家介紹的是一篇今年6月份在Theranostics雜志上發(fā)表的一篇文章，影響因子8.577分，文章作者是來自中國浙江大學(xué)邵逸夫醫(yī)院的徐建斌和宋章法，題目是：環(huán)狀RNA（circRHOBTB3）通過調(diào)節(jié)HuR介導(dǎo)的PTBP1穩(wěn)定性抑制結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移。

原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34158864

一、研究背景

結(jié)直腸癌（CRC）是第三種最常見的癌癥，也是跟癌癥相關(guān)死亡的主要原因。遺傳和表觀遺傳水平的改變普遍被認(rèn)為是大腸癌發(fā)生和發(fā)展的主要因素。基因遺傳改變主要體現(xiàn)在染色體不穩(wěn)定、微衛(wèi)星不穩(wěn)定以及一些關(guān)鍵驅(qū)動基因的改變；表觀遺傳的改變主要指CpG島甲基化表型。隨著早期篩查和基因組圖譜檢測體細(xì)胞變異的實(shí)施，越來越多的結(jié)腸癌患者實(shí)現(xiàn)了早期診斷和有針對性的治療。但是，目前大多數(shù)結(jié)腸癌患者死于晚期疾病或者復(fù)發(fā)，主要原因是腫瘤發(fā)生了轉(zhuǎn)移。因此，迫切需要更好地了解結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的驅(qū)動因素和分子機(jī)制，以制定更好的治療策略。

目前通過高通量測序以及生物信息學(xué)算法發(fā)現(xiàn)在不同的癌癥中有越來越多的功能性CircRNA，但是對結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的影響和潛在機(jī)制仍不清楚。

二、研究方法

通過RNA-seq和QPCR篩選CRC組織和鄰近正常組織之間差異表達(dá)的circRNA。CCK-8、細(xì)胞遷移和劃痕愈合試驗(yàn)以確定circRHOBTB3在細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移中的功能。RNA-pulldown 和RNA免疫沉淀試驗(yàn)驗(yàn)證 circRHOBTB3 和 HuR（ELAVL1）蛋白之間的相互作用。進(jìn)一步的 RNA-seq 和功能救援實(shí)驗(yàn)尋找下游目標(biāo)基因。最后進(jìn)行了裸鼠異種移植模型，以闡明 circRHOBTB3 對體內(nèi)癌癥轉(zhuǎn)移的影響。

三、研究結(jié)果

1? circRHOBTB3在結(jié)直腸癌組織中低表達(dá)

作者通過選取3對結(jié)腸癌患者的癌組織和旁癌正常組織進(jìn)行高通量測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，496個CircRNA分子有顯著變化，其中403個環(huán)狀RNA分子的表達(dá)量顯著降低，93個環(huán)狀RNA分子的表達(dá)量顯著升高。然后選取TOP 前10的環(huán)狀RNA分子進(jìn)行后續(xù)的癌組織樣本QPCR驗(yàn)證，表明9個CircRNAs具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其中circRHOBTB3的P值最小，豐富度較高。最后作者通過對腫瘤組織分離原代細(xì)胞（腫瘤細(xì)胞以及基質(zhì)細(xì)胞），結(jié)果發(fā)現(xiàn)circRHOBTB3在基質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)沒有明顯變化。

2? CRC患者中circRHOBTB3的表達(dá)及特征

作者通過對83例不同臨床分期的大腸癌組織樣本circRHOBTB3的表達(dá)觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)晚期患者臨床樣本組織circRHOBTB3的表達(dá)量相對于早期顯著降低。circRHOBTB3由Alu基因的外顯子6和7的反向剪接形成。通過向外發(fā)散引物和向內(nèi)收斂引物以及Sanger測序驗(yàn)證了circRHOBTB3的反向剪接位點(diǎn)，同時也表明了在cDNA中能檢測到circRHOBTB3，而在gDNA中檢測不到circRHOBTB3。另外，circRHOBTB3耐RNase R。最后通過定量circRHOBTB3在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的水平來檢查其定位，F(xiàn)ISH結(jié)果表明circRHOBTB3在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中都有所分布。

3? circRHOBTB3抑制CRC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移

通過QPCR的方法檢測circRHOBTB3在正常結(jié)腸上皮細(xì)胞和不同結(jié)腸癌細(xì)胞，結(jié)果表明circRHOBTB3的表達(dá)量在正常細(xì)胞中顯著高于癌細(xì)胞。在HCT116和Colo320這兩株細(xì)胞中過表達(dá)circRHOBTB3，結(jié)果表明侵襲和遷移能力明顯減弱，同時在DLD-1和SW480這兩株細(xì)胞中敲低circRHOBTB3，結(jié)果表明侵襲和遷移能力明顯增強(qiáng)。由于發(fā)現(xiàn)了circRHOBTB3可能跟細(xì)胞的轉(zhuǎn)移有關(guān)，作者通過WB檢測EMT相關(guān)蛋白分子，結(jié)果說明過表達(dá)circRHOBTB3對結(jié)腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移有一定的抑制作用。

4? circRHOBTB3和HUR結(jié)合并對HUR降解作用

作者為了探討circRHOBTB3在大腸癌轉(zhuǎn)移中的調(diào)控機(jī)制，通過4個在線網(wǎng)站分析能和circRHOBTB3結(jié)合的分子，結(jié)果篩選出三個蛋白分子（SRSF1，F(xiàn)US和HuR）。接下來通過RNA-pulldown和RIP驗(yàn)證circRHOBTB3分子分別和SRSF1,FUS and HuR的結(jié)合關(guān)系，結(jié)果表明circRHOBTB3和HuR相互結(jié)合的關(guān)系。通過觀察過表達(dá)或者敲低circRHOBTB3后HuR的表達(dá)量，QPCR和WB結(jié)果表明，在過表達(dá)circRHOBTB3的菌株中，HuR的蛋白表達(dá)量顯著降低，反之則相反，而HuR mRNA表達(dá)水平并沒有影響。因此作者假設(shè)circRHOBTB3可能在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)HuR蛋白的穩(wěn)定性，作者通過實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)發(fā)現(xiàn)circRHOBTB3能夠通過對β-Trcp1調(diào)節(jié)作用起到對HuR蛋白有效的降解。

5? circRHOBTB3降解HUR以降低下游靶基因PTBP1的表達(dá)水平

作者通過構(gòu)建過表達(dá)circRHOBTB3穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，進(jìn)行高通量測序（RNA-seq），通過分析選取PTBP1作為后續(xù)的研究基因，接著作者通過QPCR和WB實(shí)驗(yàn)證明PTBP1的表達(dá)水平受到circRHOBTB3和HUR的相互作用。

6? circRHOBTB3抑制PTBP1表達(dá)水平調(diào)節(jié)細(xì)胞轉(zhuǎn)移作用

通過侵襲、遷移實(shí)驗(yàn)以及WB結(jié)果表明，過表達(dá)PTBP1能夠部分逆轉(zhuǎn)circRHOBTB3對細(xì)胞遷移和侵襲的抑制作用。

7? 動物實(shí)驗(yàn)

作者為了研究circRHOBTB3在體內(nèi)控制大腸癌轉(zhuǎn)移的作用，通過構(gòu)建過表達(dá)circRHOBTB3或同時過表達(dá)circRHOBTB3和PTBP1的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，將細(xì)胞通過裸鼠尾靜脈植入肺腔。活體成像結(jié)果顯示過表達(dá)circRHOBTB3組熒光素酶活性顯著降低，HE染色結(jié)果表明過表達(dá)circRHOBTB3組腫瘤形成顯著減少。然后在同時過表達(dá)circRHOBTB3和PTBP1組在一定程度逆轉(zhuǎn)了這種現(xiàn)象。該部分結(jié)果說明了circRHOBTB3在體內(nèi)抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。取材病灶部分組織做WB和IHC實(shí)驗(yàn)，分別檢測HUR、PTBP1和EMT相關(guān)蛋白分子，circRHOBTB3組表達(dá)降低，跟體外細(xì)胞結(jié)果相一致。

四、結(jié) 論

研究結(jié)果表明，circRHOBTB3 通過 HuR/PTBP1 軸對 CRC 侵襲性產(chǎn)生抑制作用。