正在進行的COVID-19大流行已導致全球179萬人死亡，在許多國家仍未得到控制，造成了緊急的全球危機，冠狀病毒是一種正鏈RNA病毒，在人類流行的季節(jié)性冠狀病毒會引起輕微的、類似普通感冒的癥狀。在動物中傳播新型冠狀病毒已突破物種屏障，造成人類感染。21世紀，三次引人注目的冠狀病毒疫情暴發(fā)，表明該病毒家族具有跨物種、迅速傳播并奪去無數(shù)生命。SARS-CoV-2大流行推動了冠狀病毒研究。因此，迫切需要更好地理解SARS-CoV-2生物學和識別潛在治療靶點，在冠狀病毒生物學更廣泛背景下獲取和解釋這些知識，為未來可能爆發(fā)的疫情做準備也至關重要。

2021年 2月10日，洛克菲勒大學病毒學和傳染病實驗室Hoffmann 課題組在Cell Host & Microbe（IF 15.923）在線發(fā)表了題為 Functional interrogation of a SARS-CoV-2 host protein interactome identifies unique and shared coronavirus host factors? 的研究論文。

一、結果展示

? CRISPR-Cas9文庫篩選SARS-CoV-2感染必需宿主蛋白

前期研究利用SARS-CoV-2的26個蛋白分別轉染到KEK293T，免疫共沉淀鑒定332個互作宿主蛋白。根據(jù)篩選到的互作蛋白定制個性化CRISPR-Cas9文庫，靶向332個基因，共3944條sgRNAs（含314條對照和310條參與細胞存活和增殖），進一步篩選出SARS-CoV-2感染和誘導病變的必需因子（圖1A）。為了確定必需宿主因子對溫度依賴的差異，作者分別在33℃和37℃條件下（模擬上呼吸道和下呼吸道），將CRISPR-Cas9文庫病毒轉導到Huh-7.5 肝癌細胞（表達ACE2（SARS-CoV-2細胞受體）和TMPRSS2（SARS-CoV-2進入細胞的）），經(jīng)過嘌呤霉素和病毒感染篩選獲得基因組DNA，通過高通量測序（圖1B）及生信分析，分別獲得42（33℃）和43（37℃）個候選基因顯著影響SARS-CoV-2誘導的細胞死亡；其中，21（33℃）和23（37℃）個候選基因被認為是潛在的宿主因子促進SARS-CoV-2-induced細胞死亡（紫色）；然而21（33℃）和20（37℃）個是病毒生命周期拮抗劑的基因（橘色）（圖1C，1D），結果表明SARS-CoV-2誘導的互作蛋白對于病毒感染或病毒誘導的細胞死亡是必不可少的。對2個溫度下篩選的富集和耗竭基因取交集，分別獲得不同的基因列表（圖1E）。

圖1 CRISPR篩選SARS-CoV-2相互作用蛋白

? 多種冠狀病毒感染篩選宿主必需基因

同一家族的不同病毒感染可能需要共同的和特異的宿主基因參與，從功能上區(qū)分這些需求，對病毒宿主生物學有一個全面的了解；從應用角度，能夠鑒定冠狀病毒共同作用的靶點。研究者增加了3個冠狀病毒HCoV-229E, HCoV-NL63和 HCoV-OC43 的感染篩選（圖2A）。四個冠狀病毒篩選獲得共同的顯著富集基因子集，比如Rab GTPases，HOPS 復合物的組成部分，EMC1，GPI 錨定生物合成是冠狀病毒感染和誘導病變必需的宿主基因（圖2B-2E）。

圖2 不同冠狀病毒感染篩選病毒特異和公共的宿主因子

通過siRNA分別干擾候選基因表達，檢測病毒抗原(N蛋白)或者病毒復制中期的雙鏈RNA，結果表明這些基因的一個子集是病毒復制和傳播所必需的。隨后研究者選擇A549進一步驗證，結果表明，分別敲低多個靶基因顯著抑制病毒感染A549細胞，進一步證明了篩選宿主互作基因的有效性和普遍性（圖3B-3C）。

圖3 高度可信的SARS-CoV-2感染宿主蛋白驗證

? 篩選互作蛋白與具有功能的互作蛋白

接下來，研究者以病毒餌蛋白為中心，將CRISPR篩選的靶蛋白繪制蛋白互作網(wǎng)絡圖（圖4A）。隨后探索了對于給定的誘餌蛋白，宿主靶蛋白數(shù)量是否可以預測功能相互作用的百分比，作者使用超幾何檢驗測試了每種誘餌蛋白在功能性靶蛋白中的富集情況，結果表明Orf9c誘餌蛋白在功能性互作蛋白中被顯著富集（圖4B）。有趣的是，與許多宿主蛋白互作的誘餌蛋白（如Orf8，Nsp13）有相對較少的功能性互作靶蛋白；然而Nsp7，Nsp8，Orf9c誘餌蛋白有較多的功能性互作靶蛋白。假定的SARS-CoV-2相互作用332個互作蛋白中，87個靶蛋白為SARS-CoV-2感染必需的；與SARS-CoV-2相互作用的有些靶蛋白，對一種或多種其他冠狀病毒感染是必要的，但對SARS-CoV-2的感染不是必要的，如DDX10, RPL36,GNG5和CYB5B （圖2E-4A）。

結果表明，在功能性需要的宿主蛋白中，宿主與病毒相互作用蛋白被富集，但物理結合和功能需要之間的關系并不嚴格一致。

圖4 CRISPR篩選的網(wǎng)絡覆蓋圖

二、結論

綜上所述，該研究通過CRISPR-Cas9文庫（靶向332個SARS-CoV-2互作蛋白）篩選不同冠狀病毒感染必需的互作蛋白和功能性蛋白，展示了不同冠狀病毒感染宿主細胞在Rab GTPase和GPI錨點生物合成存在病毒特異性差異，以及參與膽固醇穩(wěn)態(tài)的多種公共互作因子的鑒定,為攔截和治療COVID-19的藥物研發(fā)提供信息并為未來的冠狀病毒暴發(fā)做好準備。