一、導(dǎo)言

小編今天給大家分享一篇2021年5月發(fā)表于Nature的關(guān)于腫瘤免疫治療的文章——TIM-3 restrains anti-tumour immunity by regulating inflammasome activation.腫瘤免疫治療是現(xiàn)在乃至未來研究的一個(gè)大熱點(diǎn)，而T細(xì)胞免疫球蛋白粘蛋白3（TIM-3）是繼PD-1/PD-L1和CTLA-4之后，又一個(gè)新興的免疫檢查點(diǎn)分子。TIM-3在腫瘤微環(huán)境中CD8⁺?T細(xì)胞上的表達(dá)被認(rèn)為是T細(xì)胞功能障礙的主要標(biāo)志，然而，TIM-3也在其他幾種類型的免疫細(xì)胞上表達(dá)，那么T細(xì)胞之外的免疫細(xì)胞很有可能參與抗腫瘤作用。在這里，研究者采用敲除TIM-3和單細(xì)胞RNA測序證明了TIM-3對(duì)樹突狀細(xì)胞（DCs）的重要性，即DCs上TIM-3的缺失——而不是CD4⁺或CD8⁺?T細(xì)胞，促進(jìn)更強(qiáng)大的抗腫瘤免疫作用。TIM-3的缺失使DCs無法表達(dá)調(diào)節(jié)程序，并促進(jìn)了CD8⁺效應(yīng)和干細(xì)胞樣T細(xì)胞的維持。此外，DCs中TIM-3的缺失導(dǎo)致活性氧簇的積累增加，從而導(dǎo)致NLRP3的激活。抑制惡性腫瘤組織激活或下游表達(dá)的細(xì)胞因子IL-1β和IL-18，完全消除了DCs中TIM-3缺失所觀察到的保護(hù)性抗腫瘤免疫。研究者揭示了TIM-3在調(diào)節(jié)DC功能中的重要作用，并強(qiáng)調(diào)了阻斷TIM-3通過調(diào)節(jié)炎癥小體的激活來促進(jìn)抗腫瘤免疫的潛力。

二、結(jié)果展示

1、樹突狀細(xì)胞上缺失TIM-3可以減少腫瘤負(fù)擔(dān)

為了探究TIM-3在T細(xì)胞中的功能，研究者制備了條件性敲除小鼠，敲除 CD4+和CD8+?T細(xì)胞、CD8+?T細(xì)胞或調(diào)節(jié)性T（Treg）細(xì)胞中的TIM-3。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CD4+和CD8+?T細(xì)胞的缺失可適度減少免疫原性MC38結(jié)腸癌的腫瘤負(fù)擔(dān)，而CD8+?T細(xì)胞或Treg細(xì)胞的缺失則沒有影響。TIM-3在自然殺傷細(xì)胞（NK）上也有表達(dá)，但是，使用Ncr1cre特異性缺失對(duì)腫瘤生長沒有影響。這些意外的發(fā)現(xiàn)，使研究者認(rèn)為TIM-3在調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫中的作用，可能主要是通過髓系細(xì)胞，特別是DCs介導(dǎo)的，其TIM-3在體內(nèi)高表達(dá)。最近，通過對(duì)人類疾病的觀察，髓系細(xì)胞中TIM-3表達(dá)的重要性變得明顯，編碼TIM-3的Havcr2基因的突變，與髓系細(xì)胞的過度激活和IL-18水平的升高有關(guān)。

?為了全面探究TIM-3的表達(dá)譜，研究者對(duì)腫瘤浸潤C(jī)D45+細(xì)胞（腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TILs））進(jìn)行了單細(xì)胞RNA測序分析（scRNA-seq），并對(duì)野生型 MC38-OVAdim腫瘤小鼠引流和非引流淋巴結(jié)中的CD45+細(xì)胞進(jìn)行測序比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在淋巴組織中，Havcr2的表達(dá)在表達(dá)經(jīng)典DC1標(biāo)志物Xcr1和Clec9a的一簇細(xì)胞中最為突出。然而，在腫瘤中，Havcr2表達(dá)于多種細(xì)胞類型，包括DCs、CD8+?T細(xì)胞、Treg細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。使用Cd11ccre敲除DCs中的TIM-3，觀察到腫瘤生長顯著減少。進(jìn)一步用 KP1.9肺腺癌細(xì)胞株進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)Havcr2cko小鼠腫瘤負(fù)擔(dān)顯著減少。DC-transfer實(shí)驗(yàn)也證明了樹突狀細(xì)胞內(nèi)在的 TIM-3的缺失足以促進(jìn)抗腫瘤免疫。研究者還比較了臨床上樹突狀細(xì)胞和T細(xì)胞上TIM-3的缺失情況，發(fā)現(xiàn)DC人群中TIM-3的缺失導(dǎo)致更好的腫瘤生長抑制。

2、TIM-3缺失的DCs擴(kuò)增干細(xì)胞樣CD8+T細(xì)胞

利用scRNA-seq，研究者分析了Havcr2^fl/fl和Havcr2^cko小鼠中攜帶 MC38-OVA^dim?腫瘤的TILs，鑒定了15種不同的細(xì)胞類型，包括4個(gè)淋巴樣細(xì)胞群，1個(gè)NK細(xì)胞群，7個(gè)不同的髓樣細(xì)胞群和3個(gè)cDC群。在Havcr2^fl/fl和Havcr2^cko小鼠的樣本中，所有的簇都有表達(dá)，但是比例不同。特別是集群0（包含單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞）、集群10和12（包含活化的B細(xì)胞）和集群7（包含CD8⁺T細(xì)胞）在Havcr2^cko小鼠的腫瘤中表現(xiàn)更為突出。

?通過分析CD8⁺T細(xì)胞（集群7），觀察到Havcr2^cko小鼠的腫瘤細(xì)胞表達(dá)更高水平的基因特征，這些基因特征存在于一系列功能狀態(tài)中，包括早期激活、效應(yīng)、記憶和記憶前體。研究者假設(shè)樹突狀細(xì)胞缺失TIM-3可能有助于誘導(dǎo)或維持干細(xì)胞樣CD8⁺T細(xì)胞，觀察到Havcr2^cko小鼠的腫瘤中PD-1單陽性TILs 的頻率和絕對(duì)數(shù)量顯著增加可支持這一觀點(diǎn)。PD-1⁺?TILs已被證明是包含干細(xì)胞樣和效應(yīng)樣CD8⁺TILs。因此，研究者評(píng)估了細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)，區(qū)分這兩個(gè)種群。研究發(fā)現(xiàn)，在Havcr2^cko小鼠中浸潤腫瘤的PD-1⁺?CD8⁺T細(xì)胞上IL-7R、CD5和CXCR5的表達(dá)增加，表明干細(xì)胞樣CD8⁺TILs數(shù)量增加。與這些結(jié)果相一致，在Havcr2^cko小鼠的腫瘤中觀察到CXCR5⁺?TIM-3^－CD8⁺T細(xì)胞的顯著擴(kuò)增，以及TCF1（記憶前體T細(xì)胞的特征）。研究者進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)CX3CR1、T-bet和ki67的表達(dá)增加，表明進(jìn)入效應(yīng)譜系的細(xì)胞數(shù)量增加。這些結(jié)果表明，DCs上TIM-3表達(dá)的缺失促進(jìn)了干細(xì)胞樣CD8⁺T細(xì)胞和效應(yīng)T細(xì)胞的維持，共同促進(jìn)了Havcr2^cko小鼠腫瘤的保護(hù)性免疫應(yīng)答。

3、TIM-3缺失增強(qiáng)抗原特異性免疫

通過對(duì)單細(xì)胞數(shù)據(jù)集中的髓系細(xì)胞進(jìn)行亞群分析，發(fā)現(xiàn)10個(gè)不同轉(zhuǎn)錄的亞群，這些亞群在Havcr2^fl/fl和Havcr2^cko小鼠的腫瘤中都有表達(dá)，但比例不同。特別是集群0（CCR5表達(dá)單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞）在Havcr2^cko小鼠的腫瘤中富集。相反，在集群9（嗜中性粒細(xì)胞）、集群6（DC1s）和集群8（migDCs）中的比例較小。

?migDC群已經(jīng)被證明在腫瘤微環(huán)境中獲得調(diào)節(jié)程序，導(dǎo)致成熟的樹突狀細(xì)胞富含免疫調(diào)節(jié)分子（mregDCs），抑制了這些細(xì)胞的免疫原性潛力。在髓細(xì)胞上得到這個(gè)特征確實(shí)突出了簇8，migDCs在Havcr2^cko小鼠中的評(píng)分較低，伴隨著免疫調(diào)節(jié)分子在 mregDCs中的表達(dá)減少，包括IL-4R、CD200、CD83和OX-40。研究者進(jìn)一步探究IL-4阻斷劑對(duì)Havcr2^cko荷瘤小鼠的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗IL-4治療可明顯延緩Havcr2^fl/fl小鼠的腫瘤生長，但對(duì)Havcr2^cko小鼠無效。這說明 TIM-3的缺失可能會(huì)阻礙mcreDC程序的獲得，使migDCs能夠獲得完整的免疫原性程序。通過對(duì)髓樣細(xì)胞群進(jìn)行評(píng)分，發(fā)現(xiàn)Havcr2^cko集群8 migDCs有明顯富集，其中與MHC I類主要組織相容性復(fù)合體相關(guān)的幾個(gè)基因，包括Wdfy4、Cybb、 Tapbpl和H2-M2被上調(diào)。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Havcr2^cko小鼠腫瘤中抗原特異性CD8⁺T細(xì)胞的頻率增加，產(chǎn)生更高水平的效應(yīng)細(xì)胞因子IFN-γ、TNF和IL-2，具有更大的細(xì)胞毒性潛能，增加顆粒B、CD107α和穿孔素的表達(dá)，導(dǎo)致體內(nèi)CD8⁺T細(xì)胞溶解活性的增強(qiáng)。

4、缺失TIM-3促進(jìn)炎癥激活

通過進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析和細(xì)胞因子分析顯示，Havcr2^fl/fl和Havcr2^cko?小鼠的腫瘤組織中IL-1β和IL-18表達(dá)水平較高。IL-1β和IL-18都是緊密調(diào)節(jié)的細(xì)胞因子，在炎癥介導(dǎo)的過程中作為成熟蛋白釋放。通過對(duì)Havcr2^fl/fl和Havcr2^cko小鼠炎性基因差異表達(dá)的研究，發(fā)現(xiàn)Havcr2^cko?migDCs的炎性基因明顯富集，包括涉及炎性基因激活的上游（Aim2和Nlrp3）和下游（Casp1、Casp4和IL18）接頭分子。?

研究者假設(shè)，內(nèi)源性損傷相關(guān)的分子模式，包括活性氧類、氧化脂質(zhì)和氧化 DNA，可能在腫瘤浸潤的Havcr2^cko?DCs 中引起炎癥組激活。事實(shí)上，Havcr2^cko?migDCs在與氧化應(yīng)激相關(guān)的基因特征上得分更高，其關(guān)鍵酶SOD1、SOD2、BAG3和PRDX5的表達(dá)上調(diào)。另外檢測了MC38-OVA^dim腫瘤的DCs的活性氧類活性，發(fā)現(xiàn)Havcr2^cko?DC1s和migDCs的活性顯著增加。此外，抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸可以完全逆轉(zhuǎn)對(duì)Havcr2^cko小鼠腫瘤生長的保護(hù)性抑制。減少 Havcr2^cko小鼠腫瘤中的氧化應(yīng)激也能完全消除IL-1β的分泌。?

最后，研究者采用3種不同的方法在體內(nèi)靶向炎癥途徑：（1）caspase 1抑制劑干擾 pro-IL-1β和pro-IL-18分裂；（2）MCC950干擾炎癥小體復(fù)合蛋白ASC寡聚化；（3）抗IL-1β和抗IL-18阻斷抗體（anti-IL-1β/IL-18）抑制下游細(xì)胞因子。每種方法都可以消除Havcr2^cko的保護(hù)性抗腫瘤免疫作用，其中anti-IL-1β/ IL-18的效果最強(qiáng)。此外，流式細(xì)胞術(shù)分析治療的Havcr2^cko小鼠腫瘤顯示完全逆轉(zhuǎn)的CD8⁺表型。值得注意的是TIM-3被證明是通過與TIR8相互作用，負(fù)向調(diào)節(jié)IL-1β和IL-18受體信號(hào)。這種相互作用在DCs中是如何發(fā)揮作用的，目前尚不清楚，但可能牽涉到一種自分泌前饋環(huán)路。在這種環(huán)路中，缺失DCs上的TIM-3會(huì)導(dǎo)致IL-1β的生成，同時(shí)增強(qiáng)IL-1β的反應(yīng)，共同促進(jìn)免疫原性DCs的產(chǎn)生。

三、總結(jié)

TIM-3已經(jīng)成為一個(gè)極具吸引力的治療靶點(diǎn)，新出現(xiàn)的數(shù)據(jù)表明，在AML和骨髓增生異常綜合征中，TIM-3的阻斷會(huì)誘發(fā)50-60%的應(yīng)答率，這表明TIM-3的阻斷可以作為髓系腫瘤的治療策略，而其他檢查點(diǎn)抑制劑的治療效果則有限。該文章證明了TIM-3的缺失，阻礙migDCs 獲得調(diào)節(jié)程序，促進(jìn)由IL-1β和IL-18驅(qū)動(dòng)的CD8⁺T細(xì)胞效應(yīng)的維持。這些結(jié)果進(jìn)一步證明了通過刺激炎癥通路治療癌癥的可行性，并強(qiáng)調(diào)了阻斷TIM-3在釋放炎癥通路以增強(qiáng)抗腫瘤免疫力方面的價(jià)值。