導(dǎo)言

今天小編分享一篇2021年4月9日發(fā)表于Cell的有關(guān)免疫治療的文章——Glioblastomas acquire myeloid-affiliated transcriptional programs via epigenetic immunoediting to elicit immune evasion.? 多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）是一種侵襲性腦腫瘤，目前的免疫治療方法尚未成功。在此，研究者探討GBM中免疫逃避的新機(jī)制。通過(guò)將GBM干細(xì)胞（GSCs）連續(xù)移植到具有免疫活性的宿主中，獲得具有逃避免疫清除的能力的GSC。從機(jī)制上講，這不是通過(guò)腫瘤亞克隆的遺傳選擇引起的，而是通過(guò)表觀遺傳免疫編輯過(guò)程引起。在免疫攻擊后，GSCs中的穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳變化得到加強(qiáng)。這些變化啟動(dòng)了骨髓細(xì)胞相關(guān)的轉(zhuǎn)錄程序，從而導(dǎo)致與腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞的募集增加。此外，在人間充質(zhì)亞型GSCs中發(fā)現(xiàn)相似的表觀遺傳學(xué)和轉(zhuǎn)錄特征。全文結(jié)論：表觀遺傳免疫可能通過(guò)重塑腫瘤免疫微環(huán)境（TME），在最具侵襲性的間充質(zhì)GBM亞型中驅(qū)動(dòng)獲得性免疫逃逸程序。

結(jié)論

? 免疫活性GBM小鼠模型中疾病相關(guān)TME的重現(xiàn)

? 免疫攻擊后GSCs中轉(zhuǎn)錄組的穩(wěn)定重組

? 免疫逃逸的GSCs部署“髓樣擬態(tài)”以建立富集髓樣的TME

? 獲得性轉(zhuǎn)錄變化與表觀遺傳免疫編輯過(guò)程一致

結(jié)果展示

工程化GSCs通過(guò)免疫活性宿主連續(xù)移植獲得免疫逃逸能力

有研究表明，GBM由具有神經(jīng)干細(xì)胞（NSC）特征的細(xì)胞驅(qū)動(dòng)；基因工程小鼠模型和患者樣品的基因組分析表明，內(nèi)源性NSC可能是GBM的起源細(xì)胞。因此，研究者從C57BL/6 J（BL6）小鼠分離的NSC中構(gòu)建了一組等基因GBM干細(xì)胞（GSCs），通過(guò)引入5種已確定的GBM驅(qū)動(dòng)基因突變中的1種：EGFRvIII或PDGFRA過(guò)表達(dá)，CRISPR/Cas介導(dǎo)的Nf1、Pten或Trp53的敲除。這些單基因敲除的GSC表達(dá)典型的NSC標(biāo)記物（NESTIN和SOX2），并保持分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的能力。接下來(lái)，生成突變的組合以對(duì)間充質(zhì)亞型進(jìn)行建模。首先，通過(guò)共同敲除Nf1和Pten（NP細(xì)胞）制備了雙突變型NSC。將GFP[+] NP細(xì)胞原位移植到免疫低下（NOD-scid-gamma [NSG]）小鼠體內(nèi)，導(dǎo)致形成小的良性生長(zhǎng)。只有進(jìn)一步用EGFRvIII過(guò)表達(dá)進(jìn)行改造，形成三重突變細(xì)胞系（NPE）才觀察到體內(nèi)具有GBM預(yù)期特征的極具侵襲性的腫瘤生長(zhǎng)和浸潤(rùn)。此外，還構(gòu)建了一種與前神經(jīng)元亞型相對(duì)應(yīng)的腫瘤起始細(xì)胞系（PPP），其腫瘤侵襲性遠(yuǎn)不及NPE。

反向相蛋白陣列（RPPA）分析證實(shí)了突變NSCs中RTK和PI3K信號(hào)通路的激活，包括ERK、Ras、Raf、mTor、Akt和Src表達(dá)的升高。已知GBM的前神經(jīng)亞型具有較低的免疫浸潤(rùn)和免疫抑制性TME，而NPE細(xì)胞更具攻擊性，以及它們與免疫逃逸性最強(qiáng)的間充質(zhì)GBM亞型的對(duì)應(yīng)關(guān)系，研究者更專(zhuān)注于用NPE模型探索免疫逃逸機(jī)制。

實(shí)驗(yàn)證實(shí)，NPE細(xì)胞在具有免疫能力的同系BL6宿主中具有致瘤性，這使研究者能夠?qū)BM細(xì)胞與免疫TME之間的相互作用進(jìn)行建模。在免疫功能低下的NSG小鼠中形成的腫瘤作為對(duì)照相比發(fā)現(xiàn)，BL6小鼠中NPE腫瘤的出現(xiàn)速度比NSG小鼠中慢（分別為25-50天和15-20天），并且大多數(shù)BL6宿主可以長(zhǎng)期存活。這些與BL6宿主免疫系統(tǒng)對(duì)NPE細(xì)胞的反應(yīng)并限制其腫瘤形成是一致的。

研究者推斷，通過(guò)從宿主進(jìn)行系列移植后，從逃避免疫監(jiān)視的BL6小鼠的腫瘤中獲得原代GSCs培養(yǎng)物，可以富集具有獲得性免疫逃逸能力的細(xì)胞。因此，從BL6小鼠的NPE腫瘤（NPE-BL6-TD）建立了新鮮的培養(yǎng)物。NPE-BL6-TD細(xì)胞被移植到第二級(jí)BL6宿主中，形成頻率更高的腫瘤。然后，將從這些繼發(fā)性腫瘤（NPE-IE）中重新獲得的GSCs培養(yǎng)物移植到第三級(jí)BL6宿主中。移植了NPE-IE細(xì)胞的小鼠顯示腫瘤形成增加，存活率明顯低于先前移植的品系。但是，將NPE和NPE-IE細(xì)胞移植到對(duì)照NSG小鼠中時(shí)，顯示出相似的致瘤性，并且沒(méi)有發(fā)現(xiàn)NPE-IE細(xì)胞在體外具有增殖優(yōu)勢(shì)。總之，這些結(jié)果表明NPE-IE細(xì)胞具有免疫逃逸能力。

免疫逃逸型NPE-IE腫瘤具有高度免疫抑制的微環(huán)境

為了確認(rèn)NPE-IE腫瘤是否由于逃逸T細(xì)胞清除能力而更具侵略性，研究者分別耗竭了NPE，NPE-BL6-TD和NPE-IE腫瘤的BL6小鼠中的CD8 T細(xì)胞群。在所有情況下都觀察到腫瘤生長(zhǎng)加快，腫瘤滲透率逐漸增加。這證實(shí)了NPE細(xì)胞系及其衍生物產(chǎn)生的腫瘤不會(huì)發(fā)生抗原丟失，而CD8 T細(xì)胞介導(dǎo)的清除正是它們主動(dòng)逃逸的原因。

?

接下來(lái)，利用流式細(xì)胞術(shù)，比較了非腫瘤腦組織中與NPE或NPE-IE腫瘤腦組織中存在的免疫細(xì)胞類(lèi)型。在荷瘤腦中，我們觀察到總的腦免疫細(xì)胞儲(chǔ)備發(fā)生了重大變化，包括巨噬細(xì)胞和CD8/CD4 T細(xì)胞（M1和M2樣巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物）的顯著增加，以及小膠質(zhì)細(xì)胞的明顯減少。此外，我們觀察到荷瘤腦中的淋巴群顯示出功能障礙的標(biāo)志物，如PD-1和TIM3的表達(dá)。重要的是，腫瘤和鄰近組織的熒光免疫組織化學(xué)表明主要的巨噬細(xì)胞群（F4/80[+] Iba1[+]）局限于腫瘤塊，并且在整個(gè)大腦中通常不增加。

?

直接分離腫瘤腫塊以進(jìn)一步表征腫瘤免疫微環(huán)境。多參數(shù)流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)顯示NPE-IE腫瘤中的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)較NPE腫瘤增加。重要的是，NPE-IE腫瘤中的單核細(xì)胞骨髓源性抑制細(xì)胞（M-MDSCs）和巨噬細(xì)胞顯著增加，腫瘤浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞表達(dá)PD-L1的水平明顯高于小膠質(zhì)細(xì)胞。與NPE腫瘤相比，沒(méi)有觀察到NPE-IE腫瘤中巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換的證據(jù)；相反，在每種情況下，巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出典型的吞噬和抗原呈現(xiàn)表型（即CD86[+]和CD11c[+]），以及免疫抑制標(biāo)記物PD-L1。自然殺傷細(xì)胞（NK）和樹(shù)突狀細(xì)胞群沒(méi)有明顯變化。

阻斷CSF-1R信號(hào)傳導(dǎo)降低NPE-IE細(xì)胞的免疫逃逸能力

以往的研究表明巨噬細(xì)胞集落刺激因子1受體（CSF-1R）是治療膠質(zhì)瘤的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。為了確定募集到NPE-IE腫瘤中的巨噬細(xì)胞是否支持免疫逃逸，在BL6小鼠中使用針對(duì)CSF-1R的靶向抗體耗竭這些細(xì)胞，這導(dǎo)致了腫瘤存活率的提高。在免疫功能不受影響的NSG移植對(duì)照中，該治療無(wú)明顯影響。因此，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在維持BL6小鼠NPE-IE腫瘤的生長(zhǎng)和免疫逃逸中起著關(guān)鍵作用。

雖然NPE-IE腫瘤中各種T細(xì)胞群的頻率沒(méi)有顯著差異，但是發(fā)現(xiàn)PD-1和LAG3標(biāo)記物陽(yáng)性的CD8和CD4 T細(xì)胞群增加。這表明NPE-IE TME表現(xiàn)出T細(xì)胞功能障礙的升高狀態(tài)和增強(qiáng)的免疫抑制功能。如前所述，兩種腫瘤類(lèi)型中的巨噬細(xì)胞對(duì)PD-1配體PD-L1的表達(dá)呈高度陽(yáng)性，我們發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)LAG3配體MHC-II的表達(dá)呈陽(yáng)性，這表明除了TAM募集外，還存在其他免疫抑制途徑。結(jié)果發(fā)現(xiàn)NPE來(lái)源的腫瘤可以逐漸逃避CD8 T細(xì)胞的清除，并建立一個(gè)越來(lái)越多的富含髓細(xì)胞和促腫瘤基因的TME，并伴隨著T細(xì)胞衰竭。

免疫逃逸細(xì)胞在免疫攻擊后發(fā)生顯著的轉(zhuǎn)錄重組

為了揭示在NPE-IE細(xì)胞中觀察到的獲得性免疫逃逸機(jī)制，研究者對(duì)其基因組、轉(zhuǎn)錄組和表觀基因組進(jìn)行了表征。重要的是，NPE和NPE-IE細(xì)胞的核型分析和全基因組測(cè)序（WGS）在比較時(shí)均未發(fā)現(xiàn)明顯的遺傳破壞。這表明在NPE-IE腫瘤中觀察到的獲得性免疫逃逸特性并不是克隆進(jìn)化或經(jīng)典的遺傳免疫編輯過(guò)程所能解釋的。因此推測(cè)NPE-IE細(xì)胞可能已經(jīng)獲得了其他支持免疫逃逸的細(xì)胞內(nèi)在的和穩(wěn)定的基因表達(dá)變化。

研究者對(duì)一組細(xì)胞進(jìn)行了mRNA-seq分析，包括單個(gè)突變系和來(lái)源于NSG腫瘤的細(xì)胞（無(wú)免疫攻擊的體內(nèi)微環(huán)境暴露的參考對(duì)照）。引人注意的是，在單個(gè)突變系中，Nf1缺失表現(xiàn)出最接近完全轉(zhuǎn)化的NPE突變體的轉(zhuǎn)錄組。僅Nf1缺失富集與GBM相關(guān)的幾個(gè)基因特征，包括顯著激活血管生成和細(xì)胞遷移途徑。這與間充質(zhì)亞型中觀察到的血管生成特征增加一致，表明Nf1的缺失可能是惡性轉(zhuǎn)化的“原發(fā)”細(xì)胞。

然而，重要的是，免疫逃逸品系（NPE-BL6-TD和NPE-IE）獲得明顯不同的轉(zhuǎn)錄模式，這不能單獨(dú)用Nf1缺失來(lái)解釋?zhuān)ㄔS多免疫相關(guān)基因。其中NPE-IE細(xì)胞中幾種趨化因子的上調(diào)，特別是Ccl9，可解釋NPE-IE腫瘤髓樣細(xì)胞含量的增加。在免疫活性宿主細(xì)胞中上調(diào)的另一個(gè)有趣的候選基因是Irf8（干擾素調(diào)節(jié)因子8）。Irf8是一種髓樣特異性的主轉(zhuǎn)錄因子，通常在造血細(xì)胞中專(zhuān)門(mén)表達(dá)，并且在髓樣譜系和巨噬細(xì)胞分化中具有已知作用。Irf8在NSC中通常是沉默的，因此，在免疫攻擊后，NPE細(xì)胞可能會(huì)不適當(dāng)?shù)亍敖俪帧惫撬柚髡{(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。總之，這些發(fā)現(xiàn)表明，體內(nèi)免疫攻擊顯著觸發(fā)了NPE細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄變化。

NPE-IE系中的免疫逃逸由表觀遺傳免疫編輯所支持

鑒于體內(nèi)免疫攻擊后誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄變化在體外擴(kuò)增后能穩(wěn)定保留，研究者推斷可能發(fā)生了表觀遺傳變化。利用亞硫酸氫鹽還原代表性測(cè)序（RRBS）分析了全基因組DNA甲基化水平。主成分分析（PCA）顯示了三個(gè)不同的組，并且在體內(nèi)移植的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了顯著的低甲基化水平。NPE-BL6-TD和NPE-IE細(xì)胞系通過(guò)PCA緊密地聚集在一起，并且與NPE細(xì)胞相比表現(xiàn)出廣泛的低甲基化水平。與mRNA-seq數(shù)據(jù)一致，免疫逃逸細(xì)胞中的許多差異去甲基化基因與免疫過(guò)程有關(guān)。

?

最重要的差異甲基化區(qū)域之一出現(xiàn)在Irf8啟動(dòng)子區(qū)和基因體中，甲基化在NPE-BL6-TD和NPE-IE系中逐漸消失，與轉(zhuǎn)錄激活增加一致。這些DNA甲基化模式的變化提示了“表觀遺傳學(xué)免疫編輯”過(guò)程。在該過(guò)程中，由免疫攻擊引起的轉(zhuǎn)錄變化得以穩(wěn)定，并被選擇用于那些具有較高免疫逃逸能力的細(xì)胞中。這將導(dǎo)致高度免疫逃逸和轉(zhuǎn)錄改變的后代。有趣的是，研究者還發(fā)現(xiàn)其他免疫逃逸調(diào)節(jié)因子包括Nt5e（CD73）和Cd274（PDL1）都存在甲基化丟失，這與這些基因在體內(nèi)被重新激活有關(guān)。?

Irf8對(duì)NPE細(xì)胞中IFN-γ和TAMs有重要作用

有研究表明，Irf8通過(guò)IFN-γ誘導(dǎo)的STAT1信號(hào)在巨噬細(xì)胞中被激活。在NPE-IE細(xì)胞系中，對(duì)IFN-γ的反應(yīng)是一個(gè)富集的狀態(tài)，因此研究者假設(shè)來(lái)自免疫TME的慢性IFN-γ信號(hào)可能刺激NPE細(xì)胞中Irf8表達(dá)的激活。通過(guò)將免疫原性NPE細(xì)胞暴露于IFN-γ，直接在體外進(jìn)行測(cè)試。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，IFN-γ處理后，Irf8在NPE-BL6-TD或NPE-IE細(xì)胞中可以更快地達(dá)到更高水平。這與Irf8位點(diǎn)DNA甲基化缺失后快速轉(zhuǎn)錄激活的啟動(dòng)一致。在體外，未免疫的NPE細(xì)胞中I型IFN信號(hào)傳導(dǎo)（通過(guò)IFN-α/β處理誘導(dǎo)）不能誘導(dǎo)與IFN-γ相同程度的Irf8表達(dá)。此外，JAK/STAT抑制劑托法替尼逆轉(zhuǎn)了NPE細(xì)胞中Irf8的表達(dá)，但未能逆轉(zhuǎn)NPE-IE細(xì)胞中Irf8的表達(dá)，這表明在NPE-IE細(xì)胞中存在JAK/STAT獨(dú)立的機(jī)制，以維持Irf8的高表達(dá)。此外，直接分離的GFP[+] NPE-BL6-TD和NPE-NSG-TD腫瘤細(xì)胞的譜分析證實(shí)了關(guān)鍵基因的激活發(fā)生在體外擴(kuò)增之前（例如Irf8，H2-Ab1）。因此，將NPE細(xì)胞暴露于具有免疫能力的體內(nèi)環(huán)境足以誘導(dǎo)這些觀察到的轉(zhuǎn)錄變化。

為了確定NPE-IE腫瘤TME內(nèi)的免疫細(xì)胞類(lèi)型，從NPE腫瘤中分離免疫細(xì)胞，并在體外與親代NPE細(xì)胞共培養(yǎng)。數(shù)據(jù)顯示，浸潤(rùn)性巨噬細(xì)胞群（F4/80[+]，CD45[hi]）可以刺激免疫原性NPE細(xì)胞中與NPE-BL6-TD和NPE-IE細(xì)胞中觀察到的類(lèi)似的轉(zhuǎn)錄變化。這表明浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞可能是體內(nèi)信號(hào)的來(lái)源，例如IFN-γ可驅(qū)動(dòng)這種反應(yīng)。此外，盡管前神經(jīng)PPP細(xì)胞在體內(nèi)不能有效地生成腫瘤或顯示免疫逃逸能力，但是研究者認(rèn)為PPP細(xì)胞仍可能對(duì)NPE腫瘤源性免疫細(xì)胞共培養(yǎng)產(chǎn)生反應(yīng)，因?yàn)樵诨颊吣[瘤中，前神經(jīng)亞型可以轉(zhuǎn)變?yōu)殚g充質(zhì)細(xì)胞。

?

PPP細(xì)胞與從NPE腫瘤分離的免疫細(xì)胞的體外共培養(yǎng)表明，類(lèi)似的轉(zhuǎn)錄程序可在神經(jīng)模型中激活。接下來(lái)構(gòu)建了NPE-IE Irf8敲除細(xì)胞系，這些表現(xiàn)出較低的攻擊性表型，并且出現(xiàn)的腫瘤的動(dòng)力學(xué)與未經(jīng)免疫的NPE細(xì)胞移植的小鼠相似。綜上表明，Irf8的激活是NPE-IE細(xì)胞免疫逃逸的重要因素，并且可能通過(guò)IFN-γ介導(dǎo)的體內(nèi)激活而發(fā)生。

人GSCs有兩種主要的轉(zhuǎn)錄亞型并且間充質(zhì)GSCs由IFN信號(hào)傳導(dǎo)決定

為了評(píng)估這些的發(fā)現(xiàn)是否與人類(lèi)疾病相關(guān)，研究者對(duì)36種低傳代患者來(lái)源的GSCs培養(yǎng)物進(jìn)行了RNA-seq和分子亞型分析。通過(guò)分析體外擴(kuò)增的GSCs，發(fā)現(xiàn)了兩種不同的亞型：S1，稱(chēng)之為非間充質(zhì)免疫標(biāo)記（non-MES[Imm]）；S2，稱(chēng)之為間充質(zhì)免疫標(biāo)記（MES[Imm]）。這些元基因模塊的富集與之前發(fā)表的基于全腫瘤轉(zhuǎn)錄本的標(biāo)記性質(zhì)相關(guān)。一個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄譜與MES[Imm]亞型相關(guān)，包括與IFN信號(hào)相關(guān)顯性特征。

值得注意的是，在富含MES[Imm]的GSCs中觀察到幾個(gè)干擾素調(diào)節(jié)因子家族成員的上調(diào)，包括Irf8和Irf7。但是，Irf1的關(guān)聯(lián)更為明顯。人Irf1也是一種IFN-γ反應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子，據(jù)報(bào)道在髓樣細(xì)胞的發(fā)育中與hIrf8一起發(fā)揮作用。此外，還發(fā)現(xiàn)MES[Imm]中CCL2的表達(dá)增加，這可能解釋了間充質(zhì)GBM中觀察到的免疫種群增加。最后，證實(shí)了工程化NPE細(xì)胞中這種MES[Imm]的富集，隨著細(xì)胞系獲得免疫逃逸能力（即NPE-IE細(xì)胞）而增加。因此，在MES[Imm]人類(lèi)GBM中也觀察到了與小鼠模型中未發(fā)現(xiàn)的相關(guān)特征。重要的是，在沒(méi)有IFN信號(hào)的情況下，這些轉(zhuǎn)錄特征在長(zhǎng)期培養(yǎng)中是穩(wěn)定且可遺傳的。這與轉(zhuǎn)錄組穩(wěn)定變化的表觀遺傳事件一致。通過(guò)將這些發(fā)現(xiàn)與獨(dú)立的，可公開(kāi)獲得的單細(xì)胞RNA-seq（scRNA-seq）數(shù)據(jù)的分析進(jìn)行比較，進(jìn)一步驗(yàn)證了MES[Imm]和Non-MES[Imm]亞型。

人MES[Imm]-GBMs與NPE-IE細(xì)胞顯示相似的DNA甲基化變化

為了評(píng)估富含MES[Imm]的人GBMs是否也能反映小鼠模型的DNA甲基化變化，在患者來(lái)源的GSCs中分析了DNA甲基化水平，結(jié)果觀察到MES[Imm]亞型中DNA甲基化水平明顯下降。此外，對(duì)來(lái)自患者GSCs的單樣本基因集富集分析（ssGSEA）表明，在MES[Imm]亞型中觀察到的低水平的DNA甲基化與先前發(fā)表的間充質(zhì)標(biāo)記相關(guān)，并且可能與相關(guān)免疫途徑（如IFN-γ反應(yīng)）的激活有關(guān)。值得注意的是，在MES[Imm]樣品中，發(fā)現(xiàn)了與小鼠模型（包括Irf 1，CCL2和Irf 8）中確定的基因和途徑相關(guān)的CpG島上的甲基化缺失。這些人類(lèi)GBM細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄重組和表觀遺傳變化與小鼠模型中觀察到的過(guò)程相似。因此，使用與在NPE-IE小鼠細(xì)胞中鑒定的機(jī)制相似的機(jī)制，人GBM還可進(jìn)行表觀遺傳學(xué)免疫編輯，以穩(wěn)定這種免疫逃逸狀態(tài)。

總結(jié)

總體而言，研究者發(fā)現(xiàn)表明，GBM腫瘤中所觀察到的亞型同一性的梯度或連續(xù)性可以通過(guò)腫瘤免疫微環(huán)境侵蝕其表觀遺傳環(huán)境和改變轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的程度來(lái)解釋。轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳重構(gòu)以及髓系譜系特異性轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄模塊的共同選擇是在TME中發(fā)生免疫攻擊后發(fā)生的腫瘤細(xì)胞內(nèi)在反應(yīng)。此外，探索巨噬細(xì)胞募集，保留和極化的相對(duì)作用，以及其他免疫細(xì)胞群的作用，需要進(jìn)行更加深入的研究。盡管研究者對(duì)人類(lèi)特征的分析與結(jié)論是一致的，但是還需要進(jìn)一步直接測(cè)試免疫細(xì)胞或細(xì)胞因子對(duì)其轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的影響。將需要更深入的特征描述和測(cè)試（PPP）模型，以明確在此確定的途徑對(duì)間充質(zhì)亞型的特異性。