唐氏綜合征（DS）是由于第21號染色體數(shù)目或結構異常，引起的以生長發(fā)育遲緩、畸形的先天性疾病，常見的為多了一條21號染色體，發(fā)病率在新生兒中約1/800。南京醫(yī)科大學的研究人員近期在J Clin Invest（影響因子11.864）發(fā)表文章，報道了皮層下神經元增殖減弱和第Ⅱ、Ⅳ層標志物表達下調，從而影響神經發(fā)生，這可能是類器官體積減少的原因；抑制DSCAM/PAK1逆轉異常的神經發(fā)生，增加DS iPSCs來源類器官體積大小。

結果展示

1、單細胞測序顯示，21三體類器官神經發(fā)育改變

研究者分別獲得來自3名DS患者的3個iPSC類器官、3個整倍體iPSC類器官和1個hESC來源類器官。組織學分析表明，類似整倍體類器官，21三體類器官顯示區(qū)域化富集和皮質層；scRNA-seq結果表明，無偏聚類識別了8種主要的細胞類型；scRNA-seq轉錄組數(shù)據(jù)與Allen Brain Atlas的3D原位雜交數(shù)據(jù)比對，類腦器官細胞簇高度匹配到胎齡（E）13.5的鼠腦部背側端腦；scRNA-seq轉錄組數(shù)據(jù)與BrainSpan比對，類器官pcw8和pcw9時與死后胎兒組織呈顯著正相關；21三體類器官在第30天觀察到前體細胞到神經元的發(fā)展軌跡呈延遲狀態(tài)；GO分析，顯著富集到神經發(fā)生，前腦發(fā)育和神經前體細胞增殖。信號通路富集分析神經發(fā)生相關的通路被顯著改變。

綜上所述，與整倍體類器官相比，DS類腦器官的神經發(fā)育被顯著改變。

圖 1. 類腦的Single-cell transcriptional 表達譜

2、染色質可接近性破壞導致三體iPSCs衍生的類腦轉錄受損

ATAC-seq結果表明，DS的21號染色體啟動子區(qū)域，染色質可接近性顯著而廣泛地增加，與整倍體iPSCs衍生的類腦相比，三體iPSCs衍生的類腦中鑒別出差異開放染色質區(qū)域(dOCRs)上調的有1785個，下調的有1695個，dOCRs被富集在神經發(fā)生和神經系統(tǒng)發(fā)育。?

Bulk RNA-seq 分析D30的2組類腦，差異表達基因中，104個基因上調，91個基因下調，與scRNA-seq數(shù)據(jù)結果一致，差異表達基因顯著富集在神經系統(tǒng)發(fā)育，細胞增殖，神經發(fā)生。共同上調和下調的基因被富集的生物進程有中樞神經系統(tǒng)神經元分化、神經元遷移和谷氨酸受體信號通路。

圖 2. 轉錄組和ATAC-seq 分析類腦

3、神經前體細胞（NPCs）增殖減少導致DA衍生的皮質類器官變小

與7天整倍體胚體相比，三體胚體周長縮短；21三體類器官的大小明顯小于整倍體類器官，類器官的擴張速度明顯減慢；研究者評估了神經上皮環(huán)路結構（頂膜和基膜的長度，環(huán)的直徑，腦室樣區(qū)域的大小，總環(huán)面積，環(huán)組織面積），21三體類器官所有參數(shù)均減小，該結果與臨床觀察到的DS患者腦體積減小一致。

圖 3. DS患者來源類腦體積大小和擴張速率減小

研究者發(fā)現(xiàn)，在三體皮層VZ樣區(qū)域 NPCs相關指標（PAX6）、增殖指標（Ki67、EdU）和SOX2表達量顯著下調。結果提示，三體NPCs增殖下降是21三體類器官體積較小的主要原因。

圖 4. D30類腦增殖研究

研究者進一步評估皮層神經元不同亞型的生成，CTIP2表達量在DS組顯著下調， TBR1無明顯差異；為了進一步研究DS的后期的發(fā)展階段，作者完成了D70類腦的scRNA-seq和組織學分析，21三體類腦中皮層深層和上層成熟神經元組成明顯減少；在三體谷氨酸能神經元中，表達皮層上層標記物的細胞比例（BRN2 ， SATB2）減少。

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因此，21三體類腦增殖減弱可能導致神經發(fā)生減少。

圖 5. 類腦的神經發(fā)生研究

4、敲除DSCAM逆轉DS類腦的增殖缺陷

前期研究表明DSCAM在21三體細胞、DS患者尸檢組織和DS動物模型中高表達。DSCAM的ocr在21三體類器官中顯示啟動子染色質開放程度顯著增加；PAK1作為DSCAM下游，調控神經前體細胞增殖和突觸可塑性；在21三體類腦中，DSCAM、PAK1的蛋白和mRNA表達量顯著高于對照組。

圖6. DS來源的皮質培養(yǎng)模型中，DSCAM-KD 挽救受損的 DSCAM-PAK1 信號

研究者利用CRISPR/Cas9敲除DSCAM或CRISPR干擾DSCAM，構建 DSCAM-KD iPSCs或CRISPRi-based DSCAM-KD ，隨后衍化為類腦。核型分析顯示DSCAM-KD iPSCs來源類腦HSA21 三體；通過調控DSCAM表達，21三體類腦增殖和神經發(fā)生缺陷被恢復。

圖7. DS來源的皮質培養(yǎng)模型中，敲除DSCAM恢復異常的神經發(fā)生

5、FRAX486挽救了DS類器官的異常增殖和神經發(fā)生

研究者用一種調節(jié)PAK1磷酸化的抑制劑 FRAX486處理DS1類腦， 降低了p-PAK1蛋白水平；在神經上皮環(huán)的異常結構的部分救援；FRAX486在分化30天后，能有效促進NPCs增殖；通過FRAX486處理抑制PAK1，隨后增加了CTIP2和SATB2的表達，提示挽救了神經發(fā)生。

圖 8. DS類腦中下調PAK1挽救 增殖和神經發(fā)生缺陷

小結

類腦器官模型為研究DS早期發(fā)育缺陷提供了新的途徑，目前的分析為確定DS的治療靶點和篩選藥物提供了候選者。

參考文獻：Tang XY, Xu L, Wang J, Hong Y, Wang Y, Zhu Q, Wang D, Zhang XY, Liu CY, Fang KH, Han X, Wang S, Wang X, Xu M, Bhattacharyya A, Guo X, Lin M, Liu Y. Suppressing the DSCAM/PAK1 pathway reverses neurogenesis deficits in Down Syndrome patient iPSC-derived cerebral organoids. J Clin Invest. 2021 May 4:135763.?