本次向大家推薦一篇來自武漢協(xié)和醫(yī)院副主任醫(yī)師-彭濤在J Exp Clin Cancer Res雜志投的一篇文章，文章題目“Circ-MBOAT2 knockdown represses tumor progression and glutamine catabolism by miR-433-3p/GOT1 axis in pancreatic cancer”，這是剛剛在該雜志發(fā)表的，影響因子：7.068分，內(nèi)容主要講的是敲低Circ-MBOAT2靶向調(diào)控miR-433-3p/GOT1軸從而抑制胰腺癌的腫瘤進展和谷氨酰胺分解代謝。

研究背景

胰腺癌是一種惡性腫瘤，在所有癌癥中的發(fā)病率排名第六。據(jù)報道，環(huán)狀RNA（circRNA）調(diào)節(jié)胰腺癌的進展，在原來的一些基礎研究中，作者發(fā)現(xiàn)含有2個環(huán)膜結(jié)合的O-酰基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構域（circ-MBOAT2）在胰腺癌組織標本和細胞樣本中高表達，但是尚不清楚circ-MBOAT2對胰腺癌過程的調(diào)節(jié)作用。在miRNA的確認中，有相關研究表明miR-433-3p能夠抑制腫瘤發(fā)生的過程，以至作者選用它作為circ-MBOAT2相互作用的研究對象，通過網(wǎng)站預測發(fā)現(xiàn)miR-433-3p和circ-MBOAT2有相互結(jié)合的位點；在下游靶基因的選擇中，作者選擇了癌癥細胞增殖所必須的一種物質(zhì)——谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT1），其在谷氨酸代謝中非必須氨基酸的產(chǎn)生起到至關重要的作用，也有相關研究報道谷草轉(zhuǎn)氨酶對胰腺癌的增殖有著促進的作用。根據(jù)這些基礎工作，作者提出了在胰腺癌腫瘤進展過程中，circ-MBOAT2通過海綿吸附作用miR-433-3p從而使GOT1表達對腫瘤細胞的增殖有著促進作用。

研究結(jié)果

1、Circ-MBOAT2在胰腺癌組織和細胞中高表達

作者通過QPCR的方法檢測胰腺癌組織和細胞中幾個感興趣的circRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Circ-MBOAT2在胰腺癌組織以及細胞中高表達（如下圖A）。為了判斷所發(fā)現(xiàn)的Circ-MBOAT2為環(huán)狀結(jié)構，將提取的RNA加入RNase R，接著檢測Circ-MBOAT2在樣本中的穩(wěn)定性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在樣本中Circ-MBOAT2含量并沒有減少（如下圖C-D），作者接下來為了檢測Circ-MBOAT2在細胞中的定位，將樣本進行核質(zhì)分離，分別檢測Circ-MBOAT2的含量，結(jié)果表明Circ-MBOAT2主要存在于細胞質(zhì)中（如下圖E-F）

2、敲低Circ-MBOAT2對胰腺癌細胞功能的影響

作者繼續(xù)探討Circ-MBOAT2是否調(diào)節(jié)胰腺癌的形成，通過敲低Circ-MBOAT2（si- Circ-MBOAT2）在PANC-1 and SW1990的表達，觀察細胞增殖、侵襲、遷移、凋亡以及谷氨酸-草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶1（GOT1）、α-酮戊二酸、谷氨酸的mRNA表達水平，這些結(jié)果表明了在細胞水平上敲低Circ-MBOAT2的表達，能夠抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移以及下游通路中相關基因mRNA水平的降低，從而引起腫瘤細胞的凋亡（如下圖A-J）。

3、敲低Circ-MBOAT2胰腺癌細胞在動物體內(nèi)的成瘤觀察

通過成功構建敲低Circ-MBOAT2穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株（Sh- Circ-MBOAT2+SW1990），皮下接著裸鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在相同的成瘤時間，敲低Circ-MBOAT2的細胞株成瘤能力明顯降低，運用QPCR技術檢測瘤體中Circ-MBOAT2 mRNA表達水平，結(jié)果表明敲低Circ-MBOAT2組中Circ-MBOAT2的mRNA表達顯著低于Circ-MBOAT2組（如圖A-D）。

4、Circ-MBOAT2海綿吸附miR-433-3p相結(jié)合

在雙熒光素梅實驗中，通過構建包含miR-433-3p潛在結(jié)合序列的Circ-MBOAT2重組熒光宿酶報告質(zhì)粒pGL3-Circ-MBOAT2-WT及包含突變了結(jié)合序列的重組質(zhì)粒pGL3-Circ-MBOAT2-MUT；通過瞬轉(zhuǎn)的方式把重組質(zhì)粒pGL3-Circ-MBOAT2-WT以及pGL3-Circ-MBOAT2-MUT分別跟miR-433-3p mimic共轉(zhuǎn)到兩株人胰腺癌細胞PANC-1 and SW1990中，同時也設了分別跟miR-NC共轉(zhuǎn)到細胞中；結(jié)果如圖所示，在pGL3-Circ-MBOAT2-WT+miR-433-3p mimic組中，相對熒光素酶活性顯著抑制相對于pGL3-Circ-MBOAT2-MUT+miR-433-3p mimic、pGL3-Circ-MBOAT2-WT+miR-NC和pGL3-Circ-MBOAT2-MUT+miR-NC，說明了Circ-MBOAT2和miR-433-3p能夠相互結(jié)合。

通過實時熒光定量PCR檢測34對胰腺癌組織和旁癌組織中miR-433-3p的表達，結(jié)果表明在胰腺癌組織中miR-433-3p顯著表達（如圖E）；通過斯皮爾曼相關分析，Circ-MBOAT2和miR-433-3p呈負相關（如圖F）；在PANC-1和SW1990細胞中，Circ-MBOAT2顯著高表達，而miR-433-3p顯著低表達（如圖G和H）；然而在這兩株細胞中，通過si- Circ-MBOAT2敲減其在細胞中的表達檢測miR-433-3p mRNA表達水平，發(fā)現(xiàn)miR-433-3p顯著上升(如圖I)。

5、Circ-MBOAT2通過miR-433-3p調(diào)節(jié)胰腺癌的發(fā)展

作者通過上面的實驗證實了Circ-MBOAT2能海綿吸附miR-433-3p相結(jié)合的作用方式，進一步通過實驗設計Circ-MBOAT2是否通過miR-433-3p調(diào)節(jié)胰腺癌的發(fā)展。在PANC-1 和SW1990細胞中，通過合成miR-433-3p inhibitor在細胞中敲低miR-433-3p，QPCR技術檢測細胞中miR-433-3p mRNA表達水平，合成的miR-433-3p inhibitor起到一個很好的敲低作用（如下圖A）；接著作者通過在兩株細胞中瞬轉(zhuǎn)si-Circ-MBOAT2-NC、si-Circ-MBOAT2、si-Circ-MBOAT2+miR-433-3p inhibitor以及si-Circ-MBOAT2+miR-433-3p inhibitor-NC四組，分別做了細胞增殖實驗、平板克隆形成實驗、細胞凋亡、侵襲、遷移、檢測谷氨酰胺消耗、α-酮戊二酸產(chǎn)生和谷氨酸產(chǎn)生來解釋Circ-MBOAT2通過海綿吸附miR-433-3p作用調(diào)節(jié)胰腺癌的發(fā)展以及谷氨酰胺分解代謝，在細胞凋亡實驗中，si-Circ-MBOAT2、si-Circ-MBOAT2+miR-433-3p NC這兩組細胞凋亡水平無顯著變化，但是相對于si-Circ-MBOAT2-NC和si-Circ-MBOAT2+miR-433-3p inhibitor這兩組，凋亡水平顯著上升的趨勢（如下圖F）；剩下的實驗結(jié)果和細胞凋亡結(jié)果相反（如下圖C-E、G-K）

6、胰腺癌細胞中miR-433-3p和GOT1相互結(jié)合作用

同樣進行雙熒光素梅實驗，構建miR-433-3p潛在結(jié)合下游靶基因GOT1 3’UTR的重組熒光素梅報告質(zhì)粒pGL3-GOT1 3’UTR-WT和突變了結(jié)合序列的重組質(zhì)粒pGL3-GOT1 3’UTR-MUT。實驗結(jié)果表明miR-433-3p能和GOT1相結(jié)合，在pGL3-GOT1 3’UTR-WT+miR-433-3p mimic組中熒光強度顯著降低（如下圖A-C）。

同樣取34對胰腺癌組織和旁癌組織做QPCR和WB實驗檢測GOT1表達水平，結(jié)果表明在胰腺癌組織中GOT1 mRNA水平以及蛋白水平高表達，說明了GOT1在對胰腺癌的研究中有著重要的作用。在細胞層面上也檢測了GOT1的表達水平，相對于HPDE正常胰腺上皮細胞，PANC-1和SW1990兩株胰腺癌細胞中的GOT1同樣是高表達；miR-433-3p和GOT1的表達水平呈負相關；接著通過在細胞中瞬轉(zhuǎn)miR-433-3p inhibitor和miR-433-3p mimic檢測GOT1蛋白表達水平，發(fā)現(xiàn)在miR-433-3p inhibitor組中，GOT1蛋白表達水平顯著上升。

7、miR-433-3p作用于下游靶基因GOT1調(diào)控胰腺癌進展和谷氨酰胺代謝

作者通過在PANC-1和SW1990細胞中分別瞬轉(zhuǎn)miR-NC、miR-433-3p mimic、miR-433-3p mimic +pcDNA以及miR-433-3p mimic+pcDNA- GOT1四組，后面分別檢測細胞增殖、細胞凋亡、侵襲、遷移、檢測谷氨酰胺消耗、α-酮戊二酸產(chǎn)生和谷氨酸產(chǎn)生，這些結(jié)果表明了，miR-433-3p作用于下游靶基因GOT1從而抑制細胞增殖、遷移、侵襲和谷氨酰胺代謝，從而促進細胞凋亡（如下圖A-K）。

8、Circ-MBOAT2通過miR-433-3p調(diào)控GOT1表達

作者從上面一系列的實驗證實了Circ-MBOAT2能海綿吸附作用miR-433-3p，而miR-433-3p能夠跟下游靶基因GOT1相互作用從而調(diào)控胰腺癌的發(fā)展，所以作者提出了circMBOAT2是否通過分泌miR-433-3p調(diào)控GOT1的表達。結(jié)果顯示，PANC-1和SW1990細胞中的circ-MBOAT2沉默顯著下調(diào)了GOT1的mRNA和蛋白質(zhì)水平；但是miR-433-3p inhibitor能夠回挽這種影響（如下圖A-B）。

總結(jié)

本研究指出Circ-MBOAT2通過miR-433-3p/GOT1軸調(diào)節(jié)胰腺癌的腫瘤發(fā)展和谷氨酰胺分解代謝。這一發(fā)現(xiàn)提示circ-MBOAT2可能是胰腺癌的治療靶點。