盡管RT-PCR檢測病毒RNA技術，已經成為大多數國家和地區對新冠患者排查的常規手段，也是COVID-19病例診斷的金標準，但仍然需要血清學方法來表征SARS-CoV-2的體液反應。血清學檢測可以用來追蹤已經清除感染的個體（尤其是輕度或無癥狀個體）的傳播，有助于了解病毒的流行病學，并將新冠免疫人員布置在醫院的關鍵前線位置。同時，評估新型疫苗臨床研究效果也必須通過血清學方法驗證。SARS-CoV-2是有包膜的單鏈RNA病毒，包含四個結構蛋白：膜（M），包膜（E），刺突（S）和核衣殼（N），其中N和S蛋白是最具免疫原性的病毒抗原，而只有S特異性抗體才能介導病毒中和。因此，針對S蛋白的特異性抗體反應是血清學檢測的首選參數。在這里，小編分享兩種無需使用中和抗體檢測商業試劑盒或產品也能檢測新冠抗體中和能力測定的方法。

1、抑制細胞融合測定法

穩轉表達β-半乳糖苷酶的α亞基的293T細胞瞬轉SAR-COV-S蛋白基因，穩轉表達編碼β-半乳糖苷酶的ω亞基的293T細胞瞬轉人ACE2基因，轉染后2天，將表達S蛋白的細胞和表達ACE-2的細胞以1：1的比例混合，同時加入待測試的抗體樣本，并在37℃下孵育3小時后，-80℃凍融裂解細胞，用化學定量法檢測β半乳糖苷酶活性。（圖1）

圖1 抑制細胞融合測定法原理

如圖2所示，將表達S蛋白的細胞與不同的Ig抗體一起孵育，并與表達ACE2的細胞混合后，測定報告基因β-gal的活性作為細胞融合的指標。用實驗數據的最佳擬合曲線計算IC 50值。其中ACE2-Ig有效抑制SARS-CoV-2 S蛋白介導融合，IC 50值為0.65μg·ml -1。mACE2-Ig對SARS-CoV-2的IC 50值0.48μg·ml -1。對照TIGIT-Fc在該測定中未顯示任何抑制作用。表明ACE2-Ig和mACE2-Ig均表現出對SARS-CoV-2 S蛋白的有效中和活性。

圖2 2種Ig抗體有效地抑制了SARS-CoV-2-S蛋白表達細胞與ACE2蛋白表達細胞的融合

同理，今年清華大學報道，用雙熒光素酶作為報告基因的細胞融合實驗，測試了兩種單克隆抗體對登革熱病毒感染的抗細胞融合活性（圖3）。證明無需β半乳糖苷酶試劑，雙熒光素酶也可以作為細胞融合實驗的報告基因。

圖3 用雙熒光素酶作為報告基因的細胞融合實驗原理

2、流式檢測法

只需要準備表達病毒抗原的工具細胞株、檢測IgG或IgM的流式二抗、中和抗體標準品或抗原配體的標準品即可開展實驗。而且流式可以圈出目標細胞繼續后續定量分析，因此比間接法的細胞融合實驗更靈敏。經PCR確診的SARS-CoV-2感染患者標本中，與市售的化學發光免疫分析CLIA和ELISA檢測試劑相比，對201 COVID-19血清的分析靈敏度最高。

表1比較3種方法檢測COVID-19 PCR陽性患者的血清樣品抗體的靈敏度

pCG1_CoV_2019-S質粒：編碼密碼子優化的SARS-CoV-2 S重組蛋白序列（帶有跨膜區）；pcDNA3.1質粒用于模擬轉染對照。藍色熒光蛋白（BFP）和紅色熒光蛋白編碼質粒（dsRed）用作轉染的293T細胞的標記蛋白；293細胞用CoV-S和熒光蛋白（BFP）瞬轉后作為工具細胞，將pcDNA3.1和15μg熒光蛋白（dsRed）瞬轉后作為內部對照細胞。轉染后48小時，收集細胞，以1-ml等分樣的形式讓細胞在? 80°C下保存。檢測前，將等分試樣的細胞解凍，重懸于FACS緩沖液中。將每個樣品（S蛋白工具細胞和模擬轉染對照細胞）中的每個樣品的0.5×10^5個細胞接種到96孔板中，加入標準品或待測樣品的梯度稀釋液，4°C孵育30 min。用流式緩沖液洗滌兩次，加入流式二抗染色（30分鐘，4°C，抗IgG-AF647；抗IgM-BV711）。PBS洗滌兩次，然后重懸于流式緩沖液中以進行流式細胞術分析。

圖4流式檢測血樣的新冠抗體

將表達SARS-CoV-2S蛋白的293T細胞和pcDNA3.1轉染的細胞（模擬物）與COVID-19患者血清（S1-S3）或陰性對照血清（S4–S6）一起孵育）。左圖顯示了將共轉染的熒光蛋白作為轉染標記（BFP和dsRed）的細胞群的畫門。右邊的直方圖分別描繪了兩個細胞群在每個樣品中的IgM和IgG熒光信號。

圖5 通過ACE-2-Fc標準品對樣本中的SARS-CoV-2抗體進行流式定量檢測

（A）用ACE-2-Fc標準品做流式檢測，用來確定標準血清的ACE2濃度。

（B）用流式細胞術檢測標準血清。曲線擬合生成用于未知樣品絕對定量的標準曲線。

（C）EuroImmun ELISA檢測標準血清。曲線擬合生成用于未知樣品絕對定量的標準曲線。

（D）通過ELISA和SARS-CoV-2特異性IgG的細胞流式檢測，對7份COVID-19患者血樣的新冠抗體進行定量。

總結一下，抑制細胞融合法需要準備編碼抗原和配體的2種工具細胞株、中和抗體標準品和β半乳糖苷酶試劑盒。流式法只需要準備表達病毒抗原的1種工具細胞株、檢測IgG或IgM的流式二抗、中和抗體標準品即可開展實驗，而且流式可以圈出目標細胞繼續后續定量分析，因此比抑制細胞融合實驗的精確度更高。

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