紐約基因中心和紐約大學等研究機構的研究人員們，利用CRISPR 篩選SARS-CoV-2的潛在治療靶點，研究結果可能為開發(fā)有效治療COVID-19的新型藥物提供了重要見解，并揭示它們的分子靶點。

BACKGROUND

新冠病毒（SARS-CoV-2）屬于冠狀病毒科，具有較強的傳染性和低致死性。截止2020年10月，引起的新冠肺炎（COVID-19）病例數已達4000萬，死亡人數超過100萬。過去20年，已經出現(xiàn)了三個人獸共患的冠狀病毒：SARS-CoV (2002) ，MERS-CoV (2012) ，SARS-CoV-2（2019）。鑒于SARS-CoV-2已經在全球范圍內對人的生命和經濟造成重大損失，許多研究機構、政府和藥企已經致力于開發(fā)抗病毒藥物和疫苗。目前，近30種抵抗SARS-CoV-2的疫苗已經進入臨床實驗中；美國食品與藥品管理局(FDA)批準的瑞德西韋用于新冠肺炎治療，作為SARS-CoV-2的RNA依賴RNA聚合酶抑制劑。目前新冠肺炎的治療主要針對病毒本身，本研究提供了宿主基因如何影響病毒進入，并為治療提供新的途徑，有望加速易感人群的康復。

RESULTS

1、高通量篩選鑒定SARS-CoV-2感染必須基因

研究者使用人的GeCKOv2文庫病毒（~0.2 MOI）感染A549ACE2細胞，嘌呤霉素藥篩9天，隨后0.3和0.01 MOI SARS-CoV-2分別感染巴細胞，感染24h檢測核衣殼（N）蛋白表達，感染6天后存活的細胞被提取DNA用于高通量測序。研究者用3種方法（Robust rankaggregation，RIGER weighted-sum and second-best rank）鑒定的富集基因高度重疊。在低劑量和高劑量組的TOP 50中，有27個相同的基因。

Fig1. 文庫篩選寄NGS

2、富集基因參與病毒生命周期的多個方面且廣泛表達

富集的基因分別參與病毒的吸附，內吞，纖突蛋白裂解和病毒膜融合，ER-Golgi運輸，轉錄調控，聚集在少數蛋白復合物中，包括空泡ATP酶、逆轉運復合體（Retromer）、Commander、Arp2/3和PI3K。

Fig2. Top-Ranked 基因參與病毒的生命周期

為了探索是否宿主基因丟失降低SARS-CoV-2 感染是肺組織特異性或者更廣泛的表達，作者選取TOP Rank基因檢測他們在12個組織中的表達，結果表明候選基因均在組織中廣泛表達（Fig 3C）。

3、富集的基因參與病毒蛋白互作，也參與其他病毒的感染

Gordon et al. 分別表達帶標簽的SARS-CoV-2 蛋白，瞬轉細胞后，pull down與宿主互作的蛋白，質譜鑒定出與病毒蛋白互作的332宿主蛋白。在CRISPR篩選中，部分排名靠前的蛋白也被報道與病毒蛋白互作（Fig 3D），如ATP6AP1 ，ATP6V1A 分別與nsp6，M蛋白互作。ATP6AP1在低MOI和高MOI組中分別排名第2和第4；RAB7A 與nsp7互作，文庫篩選位于TOP 50。Samavarchi-Tehrani et al. 研究A549細胞中與SARS-CoV-2蛋白互作的宿主蛋白有22個與低MOI CRISPR 篩選的TOP 50一致。

有趣的是，SARS-CoV-2 和ZIKV感染的CRISPR細胞，篩選宿主基因在GO富集基因類別有更大的相似性。SARS-CoV-2 篩選的TOP 50基因中，若干宿主基因在流感病毒、ZIKV病毒感染中也顯著富集，其中包含囊泡ATP酶質子泵（參與酸化和內體加工）。

Fig3. 富集基因參與的信號通路、組織表達情況，與病毒蛋白互作，也參與其他病毒的發(fā)病機制

4、CRSPR Knockout,RNA干擾，小分子抑制劑驗證富集基因

為了驗證TOP-ranked基因阻斷SARS-CoV-2病毒感染，研究者挑選30個基因，分別構建KO細胞株，隨后用0.1 MOI SARS CoV-2感染細胞（Cas9-perturbed A549ACE2 ），感染36h，免疫熒光檢測SARS CoV-2 N蛋白，結果表明每組感染的KO細胞降低了10倍。

囊泡轉運基因如RAB7A, CCDC22, 和 VPS35，其他基因如 ACE2 ，CTSL 敲除后，顯著降低了SARS CoV-2病毒感染、病毒載量。在人的肝細胞Huh7.5ACE2 也觀察到類似的結果。siRNA 分別抑制靶基因，SARS-CoV-2 感染的細胞也顯著下降。

CRISPR 篩選的TOP-ranked基因，結合藥物-基因作用數據庫（DGIdb數據庫）篩選出69個制藥基因，研究者篩選了9個基因，是26個小分子抑制劑的主要或次要靶點（Fig.4 E）。其中有9個藥物是FDA批準的，7個是不同疾病的2期和3期臨床實驗。小分子抑制劑和瑞德西韋中，PIK-III, Compound-19, SAR405, autophinib, ALLN, tamoxifen, and ilomastat 顯著抑制了病毒的感染,病毒載量降低100倍；靶向PIK3C3 的4個抑制劑、autophinib和ALLN 組病毒載量降低1000倍。

Fig. 4 單基因驗證及藥物靶標篩選

5、單細胞測序鑒定膽固醇合成作為多個富集基因的調控機制

為了更好的理解每個基因KO后如何影響SARS-CoV-2感染和宿主基因缺失改變轉錄進程，研究者利用ECCITE-seq鑒定分子機制和抵抗病毒感染的細胞通路；研究者發(fā)現(xiàn)ATP6AP1, ATP6V1A,CCDC22, NPC1, PIK3C3,和RAB7A基因Knockout,產生相似的上調差異表達基因，并且導致脂質和膽固醇生物合成途徑上調，這6個基因的功能缺失突變可能通過類似的機制發(fā)揮作用，即抵抗病毒介導的膽固醇合成機制。差異表達的基因中，有61個和CRISPR 篩選重疊，如在6個靶基因Knockout細胞中，膽固醇表達量顯著上調。利用這一見解，作者研究了氨氯地平（amlodipine）的影響，氨氯地平處理的細胞中，病毒感染細胞數、核衣殼mRNA，噬斑形成顯著降低；amlodipine處理細胞的RNA-seq顯示的差異表達基因和ECCITE-seq相似，其中膽固醇生物合成途徑上調。

Fig.5 單細胞轉錄組

6、RAB7A Knockout降低細胞表面表達ACE2， 增加內體累積ACE2

Rab7a 是一個小的GTP酶，調控囊泡運輸和膜轉運。RAB7A Knockout細胞表面ACE2表達顯著降低。共聚焦觀察發(fā)現(xiàn)，RAB7A Knockout導致ACE2累積在胞漿和內體，少部分位于溶酶體。

Fig.6 RAB7A Knockout降低細胞表面表達ACE2， 增加內體累積ACE2

綜上所述，該研究可能為開發(fā)有效治療COVID-19的新型藥物提供了重要見解，并揭示它們的分子靶點，有望加速易感人群的康復。

參考文獻：

1.Zharko Daniloski et al. Identification of required host factors for SARS-CoV-2 infection in human cells. Cell, 2020, doi:10.1016/j.cell.2020.10.030.