2020.07.20 
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一、前言
分子+疾病+調控，是我們科研的慣用套路，如何在這個框架下產出精彩的故事和高分文章呢？今日我們以這篇文章為例：胰島素樣生長因子2 （IGF2）通過細胞外處理蛋白質聚集物來預防亨廷頓病【Insulinlike growth factor 2 （IGF2） protects against Huntington’s disease through the extracellular disposal of protein aggregates; 2020; IF=14.251】。
二、文章速讀
受損的神經元蛋白平衡是許多神經退行性疾病的一個顯著特征，突出了內質網（ER）功能的改變。之前報道過靶向轉錄因子XBP1是ER應激反應的關鍵介質，可延緩疾病的進展，減少各種神經變性模型中的蛋白質聚集。為了確定在XBP1缺失下可能解釋神經保護作用的疾病修飾基因，文章對這些動物的大腦皮層和紋狀體進行了基因表達檢測，發現胰島素樣生長因子2 （Igf2）是主要的上調基因。文章研究了IGF2信號在亨廷頓?。℉D）模型中對蛋白質聚集的影響作為證明。細胞培養研究顯示，IGF2處理降低了突變體亨廷頓蛋白和聚谷氨酰胺肽的細胞內聚集物的負荷。這些結果在HD患者和脊髓小腦失調患者的誘導多能干細胞（iPSC）培養基棘神經元中得到驗證。突變亨廷頓蛋白水平的降低與細胞內蛋白質半衰期的降低有關。IGF2引發的異常蛋白聚集水平下降與自噬活性和蛋白酶體途徑無關，而這兩種途徑是清除突變體亨廷頓蛋白的主要途徑。相反，IGF2信號通過外泌體和微泡促進可溶性突變亨廷頓蛋白的分泌，涉及肌動蛋白動力學的改變。用基因療法將IGF2注入HD小鼠大腦，在三種不同的動物模型中，突變體亨廷頓蛋白的水平顯著下降。此外，對HD患者死后腦組織和血液樣本的分析顯示IGF2水平降低。本研究發現IGF2是HD中解除管制的相關因子，作為一種抑制異常蛋白種類積累的疾病調節劑。
三、文章背景
? 蛋白質錯誤折疊和聚集是多種神經退行性疾病的先兆，如HD。分子伴侶常駐于胞液和ER以確保新合成的蛋白精確折疊。質控機制通過蛋白酶體、溶酶體、自噬途徑去除錯誤折疊的蛋白。隨著年齡的增長，蛋白酶體網絡的容量減少，可能會增加蛋白聚集和神經退化。神經退行性疾病中蛋白質穩定網絡改變的主要節點之一涉及ER，是細胞中蛋白質折疊和質量控制的主要部位。內質網應激引發了一種快速而協調的信號通路，即未折疊蛋白反應（UPR），以加強適應性程序并恢復蛋白穩定。內質網不可修復的應激通過細胞凋亡導致細胞死亡。
? UPR由激活的特殊應激轉導子啟動，強調肌醇需要的跨膜激酶/內切酶（IRE1α）是最保守的信號分支。IRE1亞型是一種位于ER的激酶和核糖核酸內切酶，在激活時，它控制編碼X-box結合蛋白1（XBP1）的mRNA的加工，導致表達穩定和活性，轉錄因子稱為XBP1s。XBP1s上調蛋白折疊相關基因、質控、ER易位和ERAD。在秀麗隱桿線蟲中，神經元中XBP1的表達控制著機體的衰老，這可能與調節正常衰老的經典信號通路包括胰島素樣生長因子（IGF）-1和FOXO （DAF16）通路相互干擾。作者此前觀察到在HD模型大腦發育過程中遺傳阻斷IRE1α/XBP1通路可導致神經保護，可以用減少異常蛋白聚集物積累的激元適應變化來解釋。這些結果說明了XBP1和UPR在神經退行性疾病進展中的更廣泛的意義，強調了確定介導神經保護的作用機制的必要性。
四、方法技術
1. XBP1基因敲除鼠
2. 實驗動物大腦皮層和紋狀體進行微陣列（SAM）分析
3. qRT-PCR
4. 細胞轉染
5. 自噬、蛋白酶體檢測
6. Western Blot
7. 脈沖追逐實驗
8. mHtt分泌與點位印跡檢測
9. 囊泡分離和納米粒子跟蹤分析
10.定量蛋白質組學
11.Rac1 pull-down和肌動蛋白動力學
12.腺病毒載體構建及體內外感染
13.模型小鼠旋轉測試
14.組織免疫熒光
15.切片顯微定量
16.HD患者血清ELISA
17.神經干細胞（NSC）誘導分化中型多脊神經元（MSN）
18.脊髓小腦共濟失調3類（SCA-3）患者真皮成纖維細胞誘導多能干細胞（IPSC）生成
19.IPSC衍生神經元生成
20.神經元興奮性刺激
21.免疫組化
五、實驗結果
1.Igf2在XBP1敲除的小鼠腦內上調
? 獲取XBP1敲除小鼠大腦皮層和紋狀體進行基因表達分析，得到差異表達基因，在兩個腦組織之間進行比較，大腦皮層和紋狀體之間的基因表達變化沒有重疊，只有Igf2的表達在兩個腦區被改變，在XBP1cKO小鼠中表達更高。
? 獨創性通路分析（IPA）提示Igf2與與Htt相關的神經功能障礙相關的關鍵生物學通路與淀粉樣前體蛋白之間存在關系。第二次IPA檢測發現Htt是幾個靶基因（Igf2、Gfap、Mmp14、Mpeg1和Serpine3）失鏈且p值最低的上游調控因子的候選基因。
? real-time PCR驗證了XBP1cKO小鼠大腦中Igf2表達水平的變化，并檢測到與野生型同窩小鼠相比Igf2有顯著增加。
2.IGF2減少polyQ和mHtt聚集
? 為確定IGF2表達對異常蛋白積累的影響，將polyQ79-EGFP表達載體與IGF2或空載體（Mock）一起轉染Neuro2a細胞，分析細胞內包涵體。發現當與IGF2載體共轉染時，polyQ79-EGFP包涵體的數量顯著減少。
? 為了評估對聚集的影響是否針對IGF2，測量共轉染IGF1表達載體的細胞中polyQ79-EGFP的積累。通過一系列的實驗說明IGF2的表達降低了polyQ79聚集物和HMW物種的水平。
? 為了確定IGF2是否在細胞外細胞室發揮作用，用富含IGF2的條件培養基處理表達polyQ79-EGFP的細胞。還包括了一個表達突變亨廷頓蛋白跨越外顯子1的片段，有85個CAG重復的構建（GFP-mHttQ85），由IGF2或空載體轉染Neuro2a細胞24 h生成的IGF2富集培養基預處理的神經2a細胞中瞬時表達polyQ79-EGFP或GFP-mHttQ85。IGF2富集處理的細胞觀察到明顯減少蛋白質聚合和夾雜物。表明IGF2可能發揮其功能以旁分泌的方式，可能通過與膜受體結合激活信號通路。此外，用胰島素處理細胞并沒有降低polyQ79-EGFP HMW物種的水平，與IGF1過表達的結果相似。
? 為了評估IGF2是否可以降低預形成聚合物的含量，表達polyQ79-EGFP或GFP-mHttQ85 24小時，然后用IGF2富集或對照培養基處理Neuro2a細胞。結果發現細胞暴露于IGF2條件下的培養基可減弱錯誤折疊polyQ79-EGFP或GFP-mHttQ85物種的負載，這表明IGF2可能會觸發異常錯誤折疊蛋白的降解或分解。
3.IGF2減少了膨脹的聚谷氨酰胺蛋白的聚集
? 為了確定IGF2表達對表達全長度mHtt的細胞模型的影響，轉染HEK293細胞與表達載體的myc標記版本的全長mHtt重復103谷氨酰胺（FL HttQ103-myc）連同IGF2或空載體（Mock）。通過western blot分析觀察到IGF2的表達導致FL HttQ103-myc的單體不溶性物種和洗滌不溶性物種的水平顯著降低。用dot - blot方法分析細胞裂解液時，也證實了上述結果。總的來說，IGF2的表達導致全長mHtt的單體和HMW形式的水平下降。
? 為了確定了IGF2在不依賴于過度表達的人類HD模型中可能的影響，該模型使用了來自患者的誘導多能干細胞（iPSCs）。因此，使用來自HD患者和對照組的iPSC生成了人中棘神經元（MSNs）。為了表達IGF2，使用2型血清將其cDNA包裝到腺相關病毒載體（AAV）中，該載體對神經元具有高度的趨向性。用AAV-IGF2或AAV-Mock轉染單分散微球培養17天，western blot檢測mHtt水平。值得注意的是，IGF2的表達導致了HD衍生的MSNs中mHtt總水平的下降。對照組的單分散二氧化硅微球培養物并沒有改變野生型Htt的水平。
? 為了驗證IGF2表達對其他疾病相關基因水平的可能影響，我們使用從SCA3患者獲得的iPSC生成神經元培養物，并將其暴露于IGF2富集的條件細胞培養液中。細胞暴露于谷氨酸導致突變體Ataxin-3的異常聚集，在洗脫劑不溶性部分中通過突變蛋白的積累來反映。將細胞暴露在富含igf2的培養基中會導致突變體Ataxin-3聚集物的水平降低。因此，IGF2在減少含聚谷氨酰胺蛋白的異常聚集方面具有更廣泛的作用。
4.IGF2降低細胞內可溶性mHtt的半衰期
細胞暴露于IGF2誘導的mHtt聚集穩態水平的降低可能是合成速率的衰減或降解的增加。在HEK293T細胞中進行了脈沖標記實驗，將mHttQ43-GFP構建物與IGF2或空載體（Mock）共轉染。為了評估轉譯率，在總周期60分鐘內，以S35標記的甲硫氨酸和半胱氨酸的脈沖增加間隔。這些實驗表明，在表達或不表達IGF2的細胞中，mHtt的生物合成是相同的。此外，一般蛋白的合成不受IGF2表達的影響。然后，用脈沖追逐法監測細胞提取物中mHttQ43-GFP水平的衰減，以消除其半衰期。IGF2的表達顯著降低了細胞提取物中mHttQ43-GFP的半衰期，但不影響蛋白質組的整體穩定性。在這些實驗中，沒有觀察到mHttQ43的HMW物種的存在，這表明IGF2正在影響可溶性或單體形式的穩定性。總之，IGF2信號降低了總mHtt的含量，并縮短了細胞內蛋白質的半衰期。
5.自噬和蛋白酶體途徑不參與IGF2誘導的polyQ聚集物的減少
? HEK293T細胞與mHttQ43-GFP和IGF2表達載體共轉染24小時后，用放射性脈沖在抑制劑存在的情況下進行追趕實驗。氯喹和硼替佐米都沒有恢復IGF2對mHtt穩定性的影響。
? 在基礎條件下，蛋白酶體抑制劑或MG132處理細胞后，細胞內包涵體數量略有增加，但在抑制劑存在的情況下，IGF2表達細胞內的polyQ79-EGFP包涵體數量沒有變化通過western blot和flter trap分析，分別測量了polyQ79-EGFP HMW的種類和聚集物，從而驗證了這些在Neuro2a細胞中的觀察結果。在IGF2處理的細胞中，抑制蛋白酶體后polyQ HMW物種形成的基礎增加消失了。這些結果表明IGF2信號可能會改變細胞內聚合/可溶形式的polyQ的比例，或者它可能會改變異常polyQ物種的方向，以介導其清除。
? 在神經元自噬上調的情況下，我們評估過表達IGF2的細胞的自噬激活。在有無polyQ79-EGFP表達載體的情況下，用IGF2轉染Neuro2a細胞。然后用氯喹抑制溶酶體活性后監測自噬，分析LC3和p62水平。結果發現IGF2不刺激Neuro2a細胞自噬，但略有減少LC3-II的積累。同樣，用氯喹處理細胞也不能恢復蛋白質。總的來說，這些結果表明，IGF2處理誘導的polyQ79-EGFP聚集量的減少與蛋白酶體和自噬/溶酶體途徑無關。IGF2可能降低可溶性和單體形式的mHtt或polyQ的水平，降低它們的聚集水平，通過轉移細胞內的平衡向非聚集形式。另外，IGF2信號通路可能會使異常蛋白種類的清除轉向一種獨立于蛋白酶體和大自噬/溶酶體活性的替代途徑。
6.IGF2信號通過細胞外小泡觸發polyQ分泌
? 使用dot blot方法分析培養基時，IGF2表達的細胞中polyQ79-EGFP的分泌增強。對細胞培養基中SOD1G85R水平的分析顯示，IGF2可誘導其分泌，而胞質標記物如微管蛋白未見變化，表明細胞未裂解或胞質泄漏。盡管信號很低，使用flter trap檢測到細胞外基礎水平存在大的polyQ79-EGFP聚集物，這一現象在表達IGF2的細胞中增加了兩倍。
? 使用siRNAs來干擾胰島素和IGF1受體(InsR和IGF1R阻斷抗體靶向IGF2受體(IGF2R)，拮抗IGF2R幾乎降低了聚Q79-EGFP分泌水平的一半，而INSR或IGF1R的敲除則降低了一半。這些結果表明，IGF2信號通過IGF2R的參與降低了聚Q79-EGFP在細胞中的負載，導致了polyQ蛋白細胞外處理。
7. IGF2通過外顯子和微囊泡刺激聚Q分泌
? 用BrefeldinA阻斷ER至高爾基體，不能抑制IGF2刺激細胞中聚Q79-EGFP的分泌。然后探索細胞外小泡中聚Q79-EGFP的存在，使用納米粒子跟蹤分析系統來確定囊泡在細胞培養基中的大小分布和濃度表達IGF2的細胞，發現IGF2表達細胞中囊泡的釋放增強，平均直徑在30~150 nm之間，而一小部分（
? 通過順序離心分離微囊和外胚層富集組分。在表達IGF2的細胞中，在這兩個組分中檢測到聚Q79-EGFP水平的增加。聚Q79-EGFP的主要單體和可溶性形式被分泌到微泡和外泌體，沒有洗滌劑不溶性HMW物種。因此，IGF2信號通過外顯子和微囊泡促進聚Q79-EGFP的分泌，降低細胞內聚Q79-EGFP的水平。
8.細胞骨架重構有助于IGF2誘導的polyQ分泌
? 為了表征IGF2刺激下的蛋白質組重構，我們應用串聯質量標記-多維蛋白識別技術(MuDP IT)定量蛋白質組學。鑒定了總共199個蛋白質，它們的表達水平發生了變化，p值0.1倍的變化。IGF2的表達不會導致蛋白質組學的改變。然而，功能富集分析表明，IGF2的表達觸發了與大分子復合物相關的蛋白質的波動、拆卸、蛋白質轉運和細胞骨架重組。由IGF2修飾的一組蛋白質與肌動蛋白細胞骨架動力學和調控有關，包括幾個肌動蛋白 結合蛋白、RhoGTPase、波形蛋白、動力蛋白激活蛋白和動力蛋白等因素。
? 由于肌動蛋白細胞骨架是調節蛋白質分泌和囊泡貿易的關鍵，探討IGF2是否對肌動蛋白細胞骨架的調節有任何影響，結果顯示IGF2處理在幾分鐘內產生了非?？斓募拥鞍讋恿W和細胞形態的變化， 在細胞胞漿中出現肌動蛋白簇和flopodia的發育增加。這些結果是通過可視化肌動蛋白細胞骨架在小鼠胚胎胚胎纖維細胞中融合的。
? 考慮到RAC1在細胞骨架動力學中的中心作用，評估了IGF2刺激下的RAC活性。結果表明，與GTP偶聯的活性Rac1的量迅速增加，治療IGF2。
? 測試肌動蛋白動力學對聚Q79-EGFP肽釋放到細胞外空間的功能貢獻。神經2a細胞瞬時轉染兩個顯性陰性 (Rac117N)和Rac1的本構活性(Rac1V12)形式。Rac117N能夠阻斷IGF2增強的聚Q79-EGFP分泌。相反，Rac1V12的表達促進了在基礎水平上分泌OlyQ79-EGFP，而在IGF2刺激的細胞中沒有觀察到差異，提示該途徑已經完全激活。用NSC23766抑制RAC1-GTPase活性，顯著降低聚Q79-EGFP的分泌。這些效應與在NSC23766存在下用IGF2處理的細胞內聚Q79-EGFP的細胞內HMW物種水平的增加平行。這些結果提示IGF2信號觸發細胞骨架動力學的快速變化，導致聚Q79-EGFP肽進入細胞外空間。
9.體內IGF2減少MHtt聚集
? 為了確定IGF2在體內對mHtt聚集水平的可能影響，進行了單側立體定向注射AAVS混合物，以交付Htt588Q95-RFP與IGF2或空矢量(Mock)進入紋狀體。在AAV分娩后兩周，對小鼠進行安樂死，并解剖紋狀體進行生化分析。在成年小鼠中，IGF2的局部表達導致mHtt聚集明顯減少。與細胞培養實驗一致，注射AAV-IGF2的HD小鼠的大腦中也減少了mHtt的單體形式。為了評估過度表達IGF2對神經元存活的影響，測量了DARPP-32水平，作為中等刺狀神經元活力的標志。與對照病毒相比AAV-IGF2處理的動物中檢測到DARPP-32明顯更高的水平。
? 考慮到使用病毒HD模型獲得的陽性結果，隨后評估了基因治療策略，在雜合狀態下在YAC128轉基因模型中提供IGF2。進行了雙側立體定向注射將AAV-IGF2或空載體導入3個月大的YAC128小鼠紋狀體，然后在四周后對腦提取物進行生化分析，發現紋狀體中全長mHtt表達減少，平均下降近80%。注射出生后第1天或第2天(P1-P2)YAC128小鼠的DAV-IGF2或對照載體，并在3個月后解剖紋狀體。免疫印跡分析表明IGF2的表達顯著降低了YAC128動物大腦中mHtt的總水平。最后，確定了使用基于IGF2的基因治療對實驗性HD臨床進展的功能后果，結果發現隨著時間的推移，IGF2進入神經系統改善了HD轉基因小鼠的平均運動性能。
? 為了補充我們的體內驗證，用第三個模型，R6/2小鼠，一個轉基因HD模型，表達了人類Huntingtin的第1外顯子，含有~150個CAG重復，這是ALLO 胞內m Htt包裹體的可視化。評估了IGF2在R6/2小鼠大腦中的作用，在AAVIGF2給藥時，觀察到mHtt陽性夾雜物含量的強烈降低， 這些實驗的量化表明，用AAV-IGF2處理的R6/2小鼠的大腦中有近60%的顯著減少。綜上所述，這些結果表明，人工執行IGF2在大腦中的表達減少了不同HD模型中異常的蛋白質聚集。
10. HD患者紋狀體和血樣中IGF2水平降低
? 進一步探討HD患者標本中IGF2表達的可能改變。Western blot分析結果顯示與對照組相比，顯示HD患者大腦中平均IGF2水平降低了近66%。
? 考慮到HD死后腦組織中IGF2水平的意外下降，評估了HD患者外周血單個核細胞(PBMCs)中IGF2的存在。結果發現HD衍生細胞IGF2水平降低，用western blot分析顯示其蛋白水平下降了近80%；而其mRNA水平下降了近90%。綜上所述，這些結果表明HD患者的腦和血細胞中IGF2水平急劇降低。
六、思路總結
? 選定一個分子X
? 確定其作用的疾病A（潛在的治療作用）?
? 選擇X可能通過機制M作用于A
? 動物模型證明X表達變化（動物疾病模型、基因敲除模型）
? 體外模型論證X的M機制（選擇M可量化及可觀察的指標）
? A樣本中X水平與對照組不同
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