小編搜了個25分多的文章來給大家講講CRISPR文庫篩選耐藥基因的思路，由劍橋大學、英國Ralph Lauren乳腺癌研究中心、挪威科技大學和京都大學4家單位共同研究，2020年2月發表在Nature genetics上。

1、文章背景

四分之三的乳腺癌是由雌激素受體（ER，estrogen receptor）調控下誘發，靶向ER通路的藥物對大部分ER+疾病婦女有效，但是相當多的女性治療無效或后期耐藥。耐藥機制的研究集中在尋找影響ER轉錄活性的染色質重塑復合物SWI / SNF（最先在酵母中發現這些染色質重塑復合物會導致交配型轉換/蔗糖不發酵SWItch mating type/Sucrose Non-Fermenting的表型，簡稱SWI/SNF）。已經發現有三類常見的SWI / SNF復合物-染色質重塑復合物：BAF(BRG-/BRM-associated factor)、P-BAF和非經典BAF（ncBAF），以及這三類SWI / SNF復合物的核心亞基：BAF（ARID1A，ARID1B，DPF1 / 2/3，SS18）、P-BAF（ARID2，PBRM1，BRD7）和ncBAF（BRD9，GLTSCR1，GLTSCR1L）。為了系統地鑒定與乳腺癌的治療反應有關的基因功能，研究者采用了全基因組CRISPR文庫篩選方法，結合三種不同的治療方式（兩組雌激素受體拮抗劑藥物和一組BETi藥物），揭示了SWI / SNF復合體是雌激素受體拮抗劑療效的決定因素。

2、CRISPR篩選顯示ARID1A是關鍵基因

研究者首先構建了全基因組CRISPR篩選文庫18,009個人類基因敲除（knock out，KO）的MCF-7乳腺癌細胞，20d時間雌激素受體阻斷劑篩選富集耐藥的CRISPR的KO庫細胞。研究者假定含溴結構域的蛋白質4（BRD4）是ER + 乳腺癌的治療靶標，用組蛋白乙酰化閱讀器靶向含溴結構域和末端外域的抑制劑（BETi，Bromo and extra-C terminal domain inhibitor）作為驗證該耐藥機制通路的藥物，用驗證藥物同時做CRISPR的KO文庫篩選。散點圖顯示在經過雌激素受體阻斷劑篩選26天以后，4個BAF蛋白相關基因比DMSO處理的對照組更多（補充圖1）。圖1a~c在經過雌激素受體拮抗劑藥物篩選26天以后，BAF, P-BAF和ncBAF相關的 sgRNA富集或耗竭情況。圖1d~f表明兩組ER靶向藥物篩選出來的sgRNA基因非常相似，而BET靶向藥物（JQ1）篩選出來的sgRNA有明顯不同。

氟維司群（Fulvestrant，雌激素受體拮抗劑， 可通過誘導雌激素受體降解，阻斷雌激素受體。

圖1a~c Log2差異倍數熱圖（a）豐度迅速增加的sgRNA：包含已知的ER通路基因；（b）豐度緩慢減少的sgRNA；（c）豐度緩慢增加的sgRNA：包含抑制腫瘤生長的基因。

d，層次聚類熱圖表示感染的第3-20天與增殖有關的sgRNA豐度減少更明顯，時間越久，減少越多；?

e，層次聚類熱圖，與DMSO治療（感染D9后的DMSO對照）相比，兩種雌激素阻斷劑（氟維司群（Fulv，從300 nM開始并逐漸減少至100 nM），100 nM 4-羥基他莫昔芬（Tamox）或抗癌藥BETi（JQ1， 1 μM減少至250 nm）處理26天后基因的log 2倍變化。

f， ARID1A（富含AT的相互作用域1A）和其他BAF的sgRNA在雌激素阻斷劑的治療下，明顯富集（數值是這些基因的sgRNA水平相對于DMSO的倍數）；而相反的是，在抗癌藥BETi治療下，ARID1A sgRNA豐度明顯減少。BAF亞基的ARID1A，ARID1B，SMARCB1和SS18基因的sg豐度在Tamox和JQ1兩種藥物條件下明顯相反。

從上面的文庫篩選出來的基因中，研究者挑選出在兩組ER靶向藥物中豐度最高、在BET靶向藥物豐度最低的ARID1A繼續展開實驗。在MCF-7和ZR-75-1細胞中驗證了由ER靶向拮抗劑介導的抑癌作用具有ARID1A依賴性。（雌激素受體拮抗劑處理條件下，si ARID1A的細胞生長更快；BETi處理條件下，siARID1A的細胞生長沒有差異）（擴展數據圖1）

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由于siARID1A的細胞增殖能力顯著上升，研究者繼續構建MCF-7兩個單克隆敲除 ARID1A細胞株（克隆11和14）。通過基于Sanger測序證實了ARID1A敲除成功（圖2a，補充圖4和源數據圖2）。

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圖2a? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 補充圖4?

源數據圖2

為了排除是脫靶效應導致的細胞增殖變化，研究者用敲除克隆和WT對照的體外生長驗證了CRISPR篩選結果，兩個ARID1A敲除的細胞克隆增殖能力變強，并且對他莫昔芬有耐藥性，但對JQ1表現出敏感性，另外兩種臨床相關的BET抑制劑（OTX015和IBET762）同樣能抑制腫瘤增殖。（圖2b和補充圖5）。

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研究者繼續做體內實驗驗證ARID1A敲除克隆促進腫瘤生長，用WT（野生型）、兩個ARID1A敲除克隆構建皮下移植腫瘤，持續飼喂雌激素，維持ER + ?腫瘤的生長，隨后用溶劑或4-羥基他莫昔芬治療。在4-羥基他莫昔芬治療下，兩個ARID1A敲除的腫瘤比野生型更大（補充圖5），這證明抗雌激素必須依賴ARID1A才能發揮功效。然而，在未經治療的條件下，在ARID1A 敲除的腫瘤明顯比WT更大（圖2c和補充圖5）。），研究者推測他莫昔芬在ARID1A- null腫瘤中的療效下降可能僅是由于腫瘤增殖能力的增加所致。

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3、ARID1A調節ER靶基因，并且是ER復合體的一部分：RNA-seq 表達譜分析

為了探索ARID1A在藥物機制中的作用，研究者使用溶劑，氟維司坦，4-羥基他莫昔芬或BETi（JQ1）處理的WT或ARID1A敲除系的四個生物細胞培養樣品進行了RNA測序（RNA-seq ），對ARID1A敲除克隆和對照的基因表達分析。不管它們是親代細胞還是WT克隆系，對照系看起來都相似（補充圖8）。

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補充圖8? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?圖2d

氟維司群和他莫昔芬顯示相似的基因表達模式，而JQ1處理則導致基因表達譜有顯著差異（圖2d和補充圖8）。但是JQ1處理ARID1A敲除和野生型的表達譜一樣。而在ARID1A敲除細胞中，被氟維司群和他莫昔芬抑制的大多數基因要么上調要么不變（圖2d）?？偟膩碚f，被氟維司群和他莫昔芬阻抑的86％的基因在ARID1A敲除細胞中不再被顯著阻抑，它們（圖2d中突出顯示）被JQ1處理顯著下調至程度與WT細胞相同。因此，即使在沒有ER拮抗劑的情況下，ARID1A缺失也導致誘導氟維司群/他莫昔芬抑制的基因的誘導上調，這暗示了ARID1A介導的對ER通路基因的抑制。

研究者用乳腺癌國際聯合會（M的ETABRIC）隊列研究中ER + ?乳腺癌患者數據驗證，在溶劑和抗雌激素條件下，ARID1A抑制的基因（在ARID1A基因敲除細胞系中被上調的基因）與在患者中被上調時的不良臨床結果相關（圖2e和補充圖6），再次證明了ARID1A是耐藥基因。

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圖2e

4、ARID1A有助于HDAC1的募集和乙?；恼{節

研究者通過快速沉淀染內源性蛋白的免疫共沉淀技術（RIME），發現在未經治療的條件下，組蛋白脫乙?；傅鞍譎DAC1是與ARID1A相互作用的蛋白（圖3a）。

圖3a

ARID1A的減少會導致HDAC1結合減少，組蛋白4乙?；脑黾右约霸谂cER靶向藥物在WT環境中通常抑制的基因相鄰的調控元件處同時發生BRD4募集（補充圖14a），最終導致BET依賴性的腫瘤增殖。

補充圖14a

臨床結果進一步驗證，具有ARID1A突變的乳腺癌患者與具有WT ARID1A的乳腺癌患者顯示具有 ARID1A突變型腫瘤的婦女的臨床結果較差（圖 6d和補充圖 14b）。

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補充圖14：ARID1A突變患者呈現ARID1A? 陰性? 圖 6d：ARID1A突變患者生存期更短

取ARID1A 突變女性的PDX腫瘤組織離體培養，經過BETi處理48 h，研究者觀察到了增殖指標Ki67的表達減少，說明具有顯著的抗腫瘤增殖作用（圖6e，f），證實了ARID1A 突變體/缺失型和WT都依賴BET蛋白才能增殖。也提示BETi具有潛在的抗癌藥物價值。（比較可惜的是，研究者沒有用JQ1治療解除耐藥的實驗證據。）

圖6e和f

為了進一步驗證ARID1A調控細胞增殖的耐藥機制，研究者進行了一系列蛋白質組學方法：包括ChIP-seq實驗，內源性相互作用的快速免疫沉淀質譜法（RIME），來鑒定ARID1A，BRG1或ER的相互作用，發現ARID1A和兩個SWI / SNF常見蛋白BRG1和SNF5（BAF47）的結合位點。SWI / SNF復合物通過先驅因子FOXA1主動結合ER之前被募集到ER 順式調控元件。ARID1A通過募集HDAC1表現出轉錄抑制作用，并且當ARID1A功能失活時，會導致HDAC1組蛋白脫乙?；?結合減弱，BRD4組蛋白4賴氨酸乙?；Y合的增加，以及隨后的BRD4驅動的轉錄和腫瘤增殖（圖6g）。感興趣的小伙伴可以查看原文。

圖6g

最后總結一下研究者的思路：首先用全基因組CRISPR文庫篩選雌激素受體阻斷劑氟維司群和他莫昔芬的耐藥靶點。其次用驗證耐藥靶點的抑制劑BETi（具有潛在的抗癌藥物價值）同時做CRISPR文庫篩選，篩選出雌激素受體阻斷劑中sgRNA高豐度并且BETi篩選下低豐度的ARID1A 和其他3個SWI / SNF復合物亞基是最關鍵的耐藥靶點。接著驗證ARID1A失活會導致ER阻斷劑抗癌藥失效。并用一系列的ChIP-seq實驗驗證ARID1A和SWI / SNF復合物亞基的轉錄調控活性。最后用臨床證據說明ARID1A突變患者預后更差，針對ARID1A突變患者，可以通過抑制BET通路來減少耐藥。

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祝大家早日發高分文章