一、研究背景

乳腺癌仍然是全世界婦女面臨的一個嚴重威脅。據(jù)估計，2018年乳腺癌新增病例超過210萬，導(dǎo)致62.7萬女性死亡。乳腺癌的死亡率主要是由于化療耐受和轉(zhuǎn)移。給予新的靶向干預(yù)可能有助于預(yù)防腫瘤發(fā)生或侵襲性轉(zhuǎn)移，從而提高晚期乳腺腫瘤患者的生存率和臨床預(yù)后。雖然乳腺癌的全球基因表達模式已被廣泛研究，但涉及晚期乳腺腫瘤的基因表達的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控尚未被充分研究。

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目前已有100多種RNA修飾的報道，其中N6-methyladenosine (m6A)修飾，是真核mRNAs中最常見的內(nèi)修飾。這種修飾的失調(diào)與人類疾病，包括惡性腫瘤密切相關(guān)。并且m6A的修飾是動態(tài)可逆的，在哺乳動物中，RNA既可以在甲基化轉(zhuǎn)移酶（METTL3、METTL14、WTAP）的作用下發(fā)生m6A甲基化修飾，又可以在FTO、ALKBH5等酶的作用下發(fā)生去甲基化修飾。近年來，越來越多的研究結(jié)果表明，m6A是一種關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄后修飾，調(diào)控mRNA和非編碼RNA的多種生物學(xué)過程，如調(diào)節(jié)前體mRNA的成熟、翻譯和降解。

二、研究結(jié)果

? RNA去甲基化酶FTO，在人類乳腺癌中表達上調(diào)

作者首先分析了分析了111例乳腺腫瘤和12例非腫瘤性乳房組織的轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征，發(fā)現(xiàn)與正常組織相比，F(xiàn)TO在乳腺腫瘤中顯著上調(diào)；同時，在乳腺癌三個臨床階段的DNBC組(ER?/PR?/Her2+)和晚期組(二級和三級)中，也發(fā)現(xiàn)FTO的上調(diào)；隨后作者進一步在乳腺癌細胞系和組織中驗證了RNA m6A的水平，發(fā)現(xiàn)在乳腺癌細胞系和乳腺腫瘤中，m6A的豐度明顯下降。通過臨床結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)FTO的上調(diào)與晚期乳腺癌患者和ER陰性乳腺癌患者的低生存率顯著相關(guān)。這些結(jié)果提示FTO的上調(diào)可能與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

? FTO顯著促進乳腺癌細胞增殖、集落形成，減少細胞凋亡

接下來，為了確定FTO是否對乳腺癌細胞生長至關(guān)重要，作者在MDA-MB-231和MCF-7細胞中穩(wěn)定敲降FTO，隨后進行了一系列細胞功能實驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO敲降后，細胞增殖和集落形成能力被抑制，細胞凋亡水平上升；同時，Mammosphere formation assay結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲降FTO后，乳腺癌細胞成球能力下降。

綜上所述，研究結(jié)果表明FTO在控制乳腺癌細胞生長、集落形成和細胞死亡方面起著重要的作用。

? 沉默F(xiàn)TO可抑制裸鼠乳腺腫瘤生長

接下來，作者進一步探究FTO在體內(nèi)的作用。首先在4T1細胞（小鼠來源的乳腺癌細胞系）中構(gòu)建了FTO敲降穩(wěn)定細胞株，然后構(gòu)建了皮下荷瘤模型。實驗結(jié)果顯示，F(xiàn)TO敲降的皮下腫瘤的生長明顯受到抑制，同時，Rhein（FTO抑制劑）實驗組小鼠也觀察到腫瘤被抑制生長；隨后，作者進一步在NOD/SCID小鼠中進行了原位異種移植實驗，并且穩(wěn)定表達熒光素酶用于活體成像，相比于對照組，F(xiàn)TO敲除組的小鼠幾乎沒有檢測到腫瘤。

此外，通過尾靜脈注射FTO敲降4T1細胞和對照細胞，建立肺轉(zhuǎn)移瘤模型。結(jié)果顯示，在FTO敲降組中，肺轉(zhuǎn)移明顯被抑制。以上結(jié)果表明FTO在體內(nèi)促進乳腺腫瘤生長和轉(zhuǎn)移中起著至關(guān)重要的作用。

? RNA-Seq分析發(fā)現(xiàn)BNIP3是FTO介導(dǎo)的m6A修飾的下游靶點

為了探討FTO的分子機制及其在乳腺癌中的下游靶點，作者用FTO敲降的細胞株MDA-MB-231和MCF-7細胞（FTO抑制劑DMOG處理）進行了轉(zhuǎn)錄組測序，GEO2R分析發(fā)現(xiàn)，在這兩個樣本中有55個具有顯著變化的基因重疊；KEGG進一步分析顯示，抑制FTO影響的差異表達基因顯著富集在細胞增殖、細胞周期和凋亡信號通路。作者進一步采用m6A-Seq來繪制MDA-MB-231細胞中m6A修飾圖譜，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)m6A信號在mRNAs的終止密碼子附近富集。隨后，作者在其中選擇FoxO信號通路中的促凋亡基因BNIP3作為FTO介導(dǎo)的m6A修飾的候選靶點進行下一步研究；BNIP3在FTO敲降和FTO抑制的細胞株中都顯著上調(diào)，且string共表達分析表明，BNIP3與凋亡基因如Bcl-2和Caspase3密切相關(guān)。

? FTO-m6A依賴機制對BNIP3的表觀遺傳學(xué)沉默

為了驗證BNIP3是FTO的下游靶點，作者檢測了乳腺癌細胞中BNIP3 mRNA的表達水平和蛋白的表達水平。與RNA-seq數(shù)據(jù)一致，BNIP3在FTO敲降細胞株MDA-MB-231和MCF-7細胞中顯著上調(diào)，并且降低細胞中Bcl2的表達，促進了Caspase 3的裂解。這些結(jié)果表明，F(xiàn)TO通過下調(diào)BNIP3來抑制細胞凋亡。接下來，作者進一步確認BNIP3是FTO-m6A修飾的靶標，m6A MeRIP分析發(fā)現(xiàn)，敲降FTO顯著提高了BNIP3基因的m6A水平。前面的m6A RNA-seq發(fā)現(xiàn)，在靠近BNIP3終止密碼子的3′UTR中鑒定出3個潛在的m6A修飾位點，熒光素酶報告實驗表明，位點#1是FTO對BNIP3 m6A調(diào)控的修飾位點。

? BNIP3是一種腫瘤抑制因子，在臨床乳腺癌患者中與FTO表達呈負相關(guān)

BNIP3作為FTO的功能靶點，是細胞凋亡所必需，提示其在乳腺癌中具有抑癌作用。通過對Oncomine數(shù)據(jù)庫的分析，作者發(fā)現(xiàn)與非腫瘤附屬組織相比，BNIP3在包括乳腺癌在內(nèi)的各種人類癌癥中下調(diào)，且過表達BNIP3激活了Caspase3的分裂，抑制了Bcl-2的表達。對R2數(shù)據(jù)集的分析發(fā)現(xiàn)，BNIP3的水平與使用紫杉烷-蒽環(huán)類藥物和他莫昔芬治療的乳腺癌患者的總生存率呈正相關(guān)。同時，通過數(shù)據(jù)庫(GSE9014)分析和免疫組織化學(xué)實驗，在乳腺腫瘤中觀察到BNIP3和FTO的表達水平呈顯著負相關(guān)。此外，在4T1皮下乳腺癌模型中，作責(zé)檢測到BNIP3在FTO抑制或FTO沉默腫瘤樣本中上調(diào)。結(jié)論：在臨床樣本中，BNIP3與FTO表達呈負相關(guān)。

? 沉默BNIP3可顯著減輕體外和體內(nèi)依賴于FTO的腫瘤生長和轉(zhuǎn)移抑制

為了探究BNIP3是否介導(dǎo)FTO依賴性腫瘤的生長和進展，作者在FTO穩(wěn)定敲除乳腺癌細胞中轉(zhuǎn)染靶向BNIP3的shRNAs，發(fā)現(xiàn)抑制BNIP3后減輕了由FTO介導(dǎo)的對細胞增殖的抑制作用，EDU實驗進一步證明了這一結(jié)論。隨后，為了驗證BNIP3在體內(nèi)的作用，作者將FTO-knockdown 4T1和雙knockdown穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞(shFTO和shBNIP3)皮下植入Balb/c小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雙重敲降(shFTO和shBNIP3)促進了小鼠乳腺腫瘤的生長。此外，在肺轉(zhuǎn)移小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，雙敲除的4T1細胞的肺轉(zhuǎn)移增加。結(jié)論：沉默BNIP3可以顯著減輕FTO依賴的體內(nèi)外腫瘤生長和轉(zhuǎn)移抑制作用。

總結(jié)

m6A去甲基酶FTO在乳腺癌中的扮演著致癌角色。在FTO低表達細胞中，BNIP3 mRNA的3'UTR被m6A甲基化，BNIP3的表達上調(diào)誘導(dǎo)凋亡。而在FTO高表達細胞中，F(xiàn)TO介導(dǎo)BNIP3的m6A去甲基化，導(dǎo)致其表達下調(diào)，從而促進細胞增殖。因此，F(xiàn)TO-m6A-BNIP3信號通路可能成為乳腺癌治療的潛在治療靶標。