一、背景

間充質干細胞（mesenchymal stem cells， MSCs）是來源于中胚層的成體干細胞，具有自我更新能力和多向分化潛能，同時還具有獨特的免疫調節(jié)能力。由于這些特點，間充質干細胞被廣泛用于細胞治療和再生醫(yī)學的研究。

間充質干細胞來源廣泛，除了最初的發(fā)現骨髓以外，人們陸續(xù)從臍帶、臍帶血、脂肪、牙髓、羊水、羊膜、胎盤等組織分離出MSCs，人臍帶間充質干細胞（human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells，hUCMSCs）是指存在于新生兒臍帶組織中的一種多功能干細胞，相比間充質干細胞的傳統來源骨髓而言，臍帶間充質干細胞具有取材方便，無創(chuàng)，含量豐富，易于分離培養(yǎng)，體外擴增迅速且生物性能穩(wěn)定，免疫原性較低且更為原始等特點，被認為是替代骨髓間充質干細胞的理想來源，具有廣闊的臨床應用前景。

二、常見分離方法

目前所使用的hUCMSCs分離培養(yǎng)方法主要有組織塊貼壁法和酶消化法兩種，也有研宄者綜合使用這兩種方法。酶消化法常使用膠原酶、胰蛋白酶、透明質酸酶中的一種或幾種處理剪碎的臍帶組織，在短時間內可以獲得hUCMSCs，但大量研究發(fā)現，組織塊貼壁法雖然花費時間更多，但所得到的hUCMSCs質量遠比酶消化法高很多，因此本文將向大家介紹用組織貼壁法進行hUCMSCs的原代分離。

三、實驗材料準備

正常足月分娩的健康嬰兒臍帶組織、手術器械、培養(yǎng)瓶/皿、青霉素100 U/mL、鏈霉素100 ug/mL、MSC nutriStem? XF Basal Mediun（BI）、MSC nutriStem? XF supplement(BI)、干細胞溫和消化酶、超凈工作臺、磷酸緩沖液、37℃、5%CO2飽和90%濕度的培養(yǎng)箱等。

四、實驗步驟

1、取新生兒臍帶，在超凈工作臺中用鑷子將臍帶放入50ml離心管中，2%青鏈霉素混合液的 PBS 緩沖液，震蕩離心管，重復清洗三遍，盡量棄除殘留的血液；

2、將臍帶完全浸入75%酒精溶液中消毒，并迅速取出，加入2%青鏈霉素混合液的 PBS 緩沖液清洗三遍，棄除殘留的乙醇；

3、將臍帶轉移至 15cm 培養(yǎng)皿中，用手術到將臍帶組織剪成3-5cm大小的小段（圖1），剝離臍帶中的臍靜脈和臍動脈（如圖2）；反復用含 2%青鏈霉素混合液的 PBS 緩沖液漂洗臍帶，直至漂洗液中無血水；

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圖1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?圖2

4、持續(xù)觀察，待細胞匯合度達到80%即可進行傳代，用組織貼壁法分離細胞，一般在一周左右可以觀察到細胞爬出來，細胞匯合度達到80%通常需要兩周以上，細胞爬出來的快慢與臍帶的質量也有一定的關系；

5、細胞培養(yǎng)：本培養(yǎng)基配方為無血清體系，因此在傳代時不能用胰酶，需要用到溫和的消化酶，取匯合度達到80%以上的細胞，吸棄原培養(yǎng)基，加入PBS清洗兩遍，吸棄PBS加入1mL的溫和消化酶，在鏡下觀察大部分細胞回縮、變圓甚至漂起，時間大約2min，加入5倍胰酶體積的PBS將細胞吹打下來，轉移至離心管中1000rpm離心5min，棄上清后加入PBS離心洗一遍，加入培養(yǎng)基吹打成單個細胞懸液，按照1：2-1：4進行傳代培養(yǎng)。

小貼士

在使用組織塊貼壁法做動物細胞原代培養(yǎng)時，有兩個比較關鍵的條件限制： ①組織塊具有足夠多的鋒利切口；②組織塊緊貼塑料培養(yǎng)皿底部。只有同時滿足以上兩點，才會有細胞從貼壁的組織塊周圍長出。所以，使用該種方法進行組織塊貼壁時，首先要將組織剪碎成細小的肉糜狀，以形成大量的鋒利切口，然后接種至培養(yǎng)皿底部進行貼壁培養(yǎng)。

五、實驗結果

分離后第五天觀察到少量細胞從組織中爬出

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分離后第十五天細胞匯合度達到80%以上（左：40X、中100X、右200X）