? ? ? ?對于流行性傳染疾病，特別是具有一定潛伏時期的病毒感染，對患病人員的確診非常重要。無論是2003年的非典還是我們現在正在遭受的新型冠狀病毒（2019-nCoV）疫情，如果在感染初期或者輕癥時期即可通過檢測手段進行確診，治愈幾率及預后情況都會大大提高。

? ? ? ?CRISPR/Cas技術以出眾的基因編輯能力聞名于世，但顯然這技術應用范圍絕不僅限于基因編輯。CRISPR/Cas技術的大牛Jennifer Doudna教授早在2016年就將該技術應用于RNA檢測，只是由于靈敏度太低而缺乏應用價值。隨后張鋒大牛利用Cas13蛋白的天然RNase活性將其改進，使之有了實際應用價值，并將其取名為SHERLOCK（Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing），并且開發(fā)了升級版的SHERLOCK v2。后來Jennifer Doudna的實驗室利用Cas12a的非特異性ssDNA降解能力開發(fā)出另一種稱為DETECTR的方法。?

? ? ? ?01、SHERLOCK的原理

? ? ? ?SHERLOCK的核心是一種叫做Cas13的CRISPR相關蛋白。Cas13包含四個不同的家族成員（Cas13a-d），是一種RNA引導的RNase，靶向RNA的單鏈區(qū)域，在具有特定堿基的靶RNA區(qū)域產生多個切割位點。Cas13表現出靶依賴性的混雜RNA酶活性，導致旁觀RNA分子的反式切割，這種效應被稱為“collateral activity （附帶活性）”。研究人員利用這一“脫靶缺陷”，加入一種可淬滅的熒光RNA，當熒光RNA被切開時，會發(fā)出熒光信號而顯示檢測結果。 最近發(fā)現其它類型CRISPR-Cas系統(tǒng)的Cas酶也顯示collateral activity ，如Cas12的亞家族。 盡管Cas13具有稱為原間隔物側翼位點（PFS）的PAM樣序列基序，僅對某些目標位點有活性，但是許多非常活躍的Cas13直系同源物，例如LwaCas13a，不顯示PFS。?

? ? ? ?DETECTR技術的原理與SHERLOCK相似。Cas12a（Cpf1）通過crRNA靶向特定的雙鏈DNA，切割目標雙鏈DNA后，會對所有的單鏈DNA發(fā)動任意切割。將ssDNA-熒光淬滅（FQ）報道基團加入反應中，在ssDNA降解時就會產生熒信號。

? ? ? ?02、SHERLOCK的流程

? ? ? ?利用SHERLOCK系統(tǒng)檢測樣品的流程為：

? ? ? ?? 收集樣品，提取樣品的DNA或者RNA；

? ? ? ?? 以提取的DNA為模板在42℃下進行等溫擴增反應，或者將RNA逆轉錄成cDNA，以cDNA為模板在42℃下進行等溫擴增反應；

? ? ? ?? 以等溫擴增產物為模板體外轉錄單鏈RNA；

? ? ? ?? 轉錄產物與Cas13和檢測探針孵育，檢測熒光信號。

? ? ? ?制備SHERLOCK系統(tǒng)需要原核表達和純化Cas13，設計crRNA并且體外轉錄，制備帶熒光標記的單鏈RNA探針。

? ? ? ?03、SHERLOCKv2

? ? ? ?與SHERLOCK比較，SHERLOCKv2具有有4個方面的改進：?

? ? ? ?? 4通道單反應多重分析，1個反應可以檢測4種核酸，使用了1個Cas13a、兩個不同菌株的Cas13b和1個Cas12a ，每個酶的crRNA不同，激活后能切割的核苷酸序列也不相同；

? ? ? ?? 可以定量測量低至2 attomolar（ 10-18摩爾? ）的底物；

? ? ? ?? 通過將Cas13與Csm6（一種與CRISPR相關的輔助酶）結合，使信號靈敏度提高3.5倍；

? ? ? ?? 切割后的報告基團可通過試紙條來檢測，不用依賴熒光。

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? ? ? ?04、SHERLOCK的優(yōu)勢

? ? ? ?與常用的診斷技術ELISA（酶聯免疫吸附劑測定）、熒光RT-PCR（實時熒光反轉錄聚合酶鏈式反應）等比較，SHERLOCK的優(yōu)勢包括：

? ? ? ?? 檢測范圍廣，SHERLOCK使用的LwaCas13a沒有PAM，因此可以檢測任何核酸序列；

? ? ? ?? 靈敏度高，可以定量測量低至2 attomolar（ 10-18摩爾）的底物；

? ? ? ?? 使用方便，用試紙條檢測不需要特殊的設備；

? ? ? ?? 成本低，每次測試僅需要0.61美元（約為4.2元人民幣）。

? ? ? ?05、SHERLOCK的應用

? ? ? ?SHERLOCK可以用于檢測寨卡病毒、登革熱病毒的特定株系，檢測大腸桿菌和綠膿桿菌的基因組，對人類DNA進行基因分型，鑒定游離DNA中的低頻率癌癥突變（Gootenberg et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 2017, 356(6336):438-442）；檢測大豆的草甘膦抗性基因（Abudayyeh et al. Nucleic Acid Detection of Plant Genes Using CRISPR-Cas13. CRISPR J.? 2019, 2:165-171）。基因編輯大牛張鋒已利用SHERLOCK系統(tǒng)檢測冠狀病毒2019-nCoV。