一、研究背景

? ? ? ?結(jié)直腸癌(CRC)是世界上第三常見的癌癥和第四致命的惡性腫瘤。雖然在過去的幾十年里，手術(shù)聯(lián)合系統(tǒng)治療已經(jīng)改善了CRC患者的預(yù)后，但腫瘤復(fù)發(fā)和肝轉(zhuǎn)移在CRC患者中仍然很常見，且與較差的生存率密切相關(guān)。因此，更好地理解CRC啟動(dòng)和進(jìn)展的機(jī)制是至關(guān)重要的。

? ? ? ?目前已有100多種RNA修飾的報(bào)道，其中4-6種為n6 -甲基ladenosine (m6A)修飾，是真核mRNAs中最常見的內(nèi)修飾。這種修飾的失調(diào)與人類疾病，包括惡性腫瘤密切相關(guān)。在哺乳動(dòng)物中，RNA既可以在甲基化轉(zhuǎn)移酶（METTL3、METTL14、WTAP）的作用下發(fā)生m6A甲基化修飾，又可以在FTO、ALKBH5等酶的作用下發(fā)生去甲基化修飾。近年來，越來越多的研究結(jié)果表明，m6A是一種關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄后修飾，調(diào)控mRNA和非編碼RNA的生物學(xué)過程。

? ? ? ? 據(jù)報(bào)道[2]，METTL3的缺失降低了DGCR8與初級microRNAs (primiRNAs)的結(jié)合，并導(dǎo)致成熟microRNAs的減少。同時(shí)，有研究發(fā)現(xiàn)METTL14與DGCR8相互作用，并以一種依賴于m6a的方式正向調(diào)控初始miR-126 (primiR-126)成熟過程[3]。

二、研究結(jié)果

1、METTL14在CRC組織和細(xì)胞系中下調(diào)，且與患者總生存率相關(guān)

? ? ? ?作者首先檢測了CRC組織和細(xì)胞系中METTL14的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與FHC（正常結(jié)腸上皮細(xì)胞）相比，在CRC細(xì)胞中檢測到較低水平的METTL14；與此類似，檢測112對CRC組織和ANTs（癌旁組織），發(fā)現(xiàn)CRC組織中METTL14的水平低于ANTs；同時(shí)，METTL14的表達(dá)下降與CRC進(jìn)展相關(guān)。

2、METTL14抑制CRC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲

? ? ? ?接下來，為了探究m6A修飾對CRC發(fā)生和發(fā)展的影響，作者在HCT116 和 HCT8 細(xì)胞中敲降METTL14，隨后檢測細(xì)胞整體m6A水平和細(xì)胞活力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲降METTL14后，兩株細(xì)胞m6A水平下降，細(xì)胞增殖活性顯著上升；同時(shí)，檢測細(xì)胞周期，結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲降METTL14后，細(xì)胞S期比列顯著增加。

? ? ? ?為了進(jìn)一步確認(rèn)METTL14對CRC細(xì)胞增殖的影響，作者同時(shí)在HCT116 和 HCT8 細(xì)胞中過表達(dá)METTL14，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)METTL14后，細(xì)胞m6A水平上升，細(xì)胞增殖被抑制，G0/G1期細(xì)胞數(shù)增多，S期細(xì)胞數(shù)下降。

? ? ? ? 隨后，探討METTL14對CRC細(xì)胞遷移和侵襲的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲降METTL14后，HCT116和HCT8細(xì)胞的遷移和侵襲能力均有顯著提高；與此相反，過表達(dá)METTL14明顯抑制CRC細(xì)胞的遷移和侵襲。

3、METTL14抑制體內(nèi)CRC的生長和轉(zhuǎn)移

? ? ? ? 接下來，作者進(jìn)一步探究METTL14在體內(nèi)的作用。首先在HCT116細(xì)胞中分別構(gòu)建了METTL14敲降和過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株細(xì)胞，然后用這兩種細(xì)胞構(gòu)建了皮下異種移植模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，METTL14敲降的異種移植瘤的生長明顯受到促進(jìn)，而METTL14過表達(dá)的移植瘤生長明顯受到了抑制；同時(shí)，免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，METTL14敲降增加了Ki67的表達(dá),而METTL14過表達(dá)降低了異種移植組織中Ki67的表達(dá)水平。

? ? ? ? 此外，通過尾靜脈注射HCT116細(xì)胞，建立裸鼠肺轉(zhuǎn)移瘤模型。結(jié)果顯示，METT14敲降組明顯促進(jìn)肺擴(kuò)張，而METTL14過表達(dá)組明顯抑制肺轉(zhuǎn)移。

4、DGCR8通過依賴于METTL14的m6A甲基化調(diào)控miR-375

? ? ? ?前面我們講到，越來越多的研究證實(shí)METTL3或METTL14是DGCR8參與各種癌癥的primiRNAs所必需的。作者因此探究在CRC中，DGCR8調(diào)控primiRNA的過程是否依賴于METT14/m6A。

? ? ? ?鑒于m6A水平的降低會(huì)導(dǎo)致primiRNA的過程停滯，并導(dǎo)致相應(yīng)miRNA水平的降低，因此，METTL14/ m6a依賴的miRNA的表達(dá)與METTL14表達(dá)正相關(guān)；作者使用TCGA數(shù)據(jù)庫分析網(wǎng)站LinkedOmics (http://www.linkedomics.org/login.php)，發(fā)現(xiàn)9個(gè)miRNA在CRC組織中發(fā)現(xiàn)與METTL14呈正相關(guān)；隨后，在METTL14敲降細(xì)胞株中檢測這些miRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-375和miR-200a表達(dá)下降，進(jìn)一步檢測兩個(gè)miRNA前體形式primiR-375和primiR-200a 的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，primiRNA-375在METTL14敲降的CRC細(xì)胞中積累，在METTL14過表達(dá)的CRC細(xì)胞中下調(diào)，而primiR-200a沒有明顯變化。

? ? ? ?為了驗(yàn)證m6A修飾在primiR-375成熟過程中的直接作用，接下來，作者把其m6A修飾的位點(diǎn)突變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，primiR-375中m6A motif的突變顯著地降低了其向成熟形態(tài)的加工。此外，免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，primiR-375與DGCR8結(jié)合的水平在METTL14過表達(dá)細(xì)胞中顯著上升，同時(shí)，METTL14過表達(dá)明顯增加了primiR-375 的m6A修飾水平。

5、miR-375是METTL14的下游靶點(diǎn)

? ? ? ?隨后，作者進(jìn)一步探討miR-375作為METTL14的下游靶點(diǎn)，在CRC進(jìn)展中的潛在分子機(jī)制，作者檢測112對CRC組織和ANTs（癌旁組織）中miR-375的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與相應(yīng)的ANTs相比，CRC組織中miR-375明顯降低，與METTL14呈正相關(guān)，且其下調(diào)與預(yù)后不良有關(guān)。

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? ? ? ?接下來，在METTL14過表達(dá)細(xì)胞中使用miR-375 inhibitor，下調(diào)miR-375的表達(dá)；并且發(fā)現(xiàn)抑制miR-375可以恢復(fù)細(xì)胞下降的增殖、遷移和侵襲能力；類似的，在METTL14敲降細(xì)胞中上調(diào)miR-375的表達(dá)，以及一系列的回復(fù)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，mir -375的表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)METTL14敲低對細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響。

6、METTL14通過miR-375/YAP1和miR-375/SP1通路抑制CRC進(jìn)展

? ? ? ?眾所周知，miR-375是一種重要的癌癥相關(guān)miRNA，許多致癌基因已被證實(shí)為miR-375的功能靶點(diǎn)，包括YAP1、SP1、AEG1、PDK1、IGF1R和JAK2。

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? ? ? ?在這里，我們發(fā)現(xiàn)METTL14過表達(dá)明顯升高miR-375的表達(dá)，并且降低YAP1和SP1的表達(dá)，免疫組化結(jié)果與此一致，而METTL14敲降增加了異種移植組織中YAP1和SP1的表達(dá)水平。因此，作者推測METTL14可能通過miR-375/YAP1和miR-375/SP1通路發(fā)揮其生物學(xué)功能。為了驗(yàn)證這個(gè)假設(shè)，作者使用熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測miR-375和其下游靶標(biāo)的結(jié)合關(guān)系，在293T 和 HCT116 細(xì)胞中，過表達(dá)miR-375后，WT組熒光水平下降，而MUT組熒光水平不變；

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? ? ? ?此外，作者在METTL14過表達(dá)細(xì)胞中轉(zhuǎn)入YAP1和SP1過表達(dá)質(zhì)粒，并進(jìn)行了一系列的回復(fù)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，YAP1提高了細(xì)胞的增殖能力，SP1提高了細(xì)胞的遷移和侵襲能力。這些結(jié)果表明METTL14通過miR-375/YAP1和miR-375/SP1通路抑制CRC進(jìn)展。

結(jié)語

? ? ? ?METTL14在CRC組織和細(xì)胞系中下調(diào)，并且與總生存率(OS)密切相關(guān)。METTL14的下調(diào)顯著降低了總RNA中m6A的水平，促進(jìn)了CRC細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移，而METTL14的過表達(dá)則顯著提高了總RNA中m6A的水平，并起到抑制CRC細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移的作用。此外，作者證實(shí)了miR-375是METTL14的下游靶點(diǎn)。并且，METTL14通過miR-375/YAP1通路抑制CRC細(xì)胞生長，以及通過miR-375/SP1通路抑制CRC細(xì)胞的遷移和侵襲。

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