? ? ? ? 經(jīng)典的中心法則是指：遺傳信息從DNA傳遞給RNA，RNA傳遞至蛋白質(zhì)，完成遺傳信息的轉(zhuǎn)錄與翻譯的過程。

? ? ? ? 轉(zhuǎn)錄過程發(fā)生在細(xì)胞核內(nèi)，主要研究DNA的修飾，轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子之間的調(diào)控，增強(qiáng)子、沉默子等相關(guān)的調(diào)控過程。轉(zhuǎn)錄后調(diào)控主要發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)，研究RNA的剪切，修飾，互作結(jié)合等相互作用關(guān)系。

? ? ? ? 之前小編已經(jīng)介紹了在DNA層次，RNA 層次，protein蛋白層次的機(jī)制驗(yàn)證和探索實(shí)驗(yàn)方式，今天再給大家介紹文章深度機(jī)制挖掘的技術(shù)：ChIRP（RNA純化的染色質(zhì)分離技術(shù)）。

? ? ? ? 一、技術(shù)原理

? ? ? ? ChIRP（Chromatin Isolation by RNA Purification）

? ? ? ? 檢測與RNA結(jié)合的基因組DNA的高通量驗(yàn)證與探索的方法，以生物素標(biāo)記的RNA做互補(bǔ)探針，結(jié)合至特異性的RNA，同時(shí)捕獲免疫吸附該RNA結(jié)合調(diào)控的蛋白以及染色體DNA片段。

? ? ? ? ?二、技術(shù)過程

? ? ? ? ?1. 設(shè)計(jì)待研究的RNA互補(bǔ)結(jié)合探針（設(shè)計(jì)Input組，陰性Lacz組，positive陽性組，奇數(shù)組，偶數(shù)組）；

? ? ? ? ?2. 體外合成或轉(zhuǎn)錄形成標(biāo)記性的短鏈寡核苷酸RNA探針；

? ? ? ? ?3. 以RNA探針為誘餌，免疫吸附結(jié)合的相關(guān)蛋白（或RNA）、染色體DNA；

? ? ? ? ?4. 鏈霉親和素磁珠結(jié)合獲取；

? ? ? ? ?5. 純化獲取分兩步：一步純化獲取結(jié)合的蛋白產(chǎn)物，一步純化獲取結(jié)合的染色體基因組DNA；

? ? ? ? ?6. DNA染色體片段經(jīng)文庫構(gòu)建及高通量測序分析，在基因組水平上獲取該RNA條款的下游靶基因，同時(shí)可結(jié)合Q-PCR驗(yàn)證結(jié)合強(qiáng)度；

? ? ? ? ?7. RNA結(jié)合蛋白經(jīng)高效液相連用質(zhì)譜分析，鑒定參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控的蛋白，在蛋白水平上結(jié)合western blot 驗(yàn)證結(jié)合強(qiáng)度。

? ? ? ? ?三、技術(shù)應(yīng)用

? ? ? ? ?1. 全基因范圍內(nèi)定位lncRNA、circRNA的結(jié)合位點(diǎn)，以及潛在的其他RNA、蛋白、基因組DNA；

? ? ? ? ?2. ChIRP可研究細(xì)胞內(nèi)相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)；

? ? ? ? ?3. ChIRP可同時(shí)在RNA、蛋白、DNA三者之間研究，也可以研究兩兩互作關(guān)系；

? ? ? ? ?4. ChIRP-RNA：可以標(biāo)記互補(bǔ)探針捕獲靶標(biāo)探針結(jié)合的RNA分子（高通量測序及Q-PCR）；

? ? ? ? ?5. ChIRP-protein：可以標(biāo)記互補(bǔ)探針捕獲靶標(biāo)探針結(jié)合的蛋白（質(zhì)譜MS及WB）；

? ? ? ? ?6. ChIRP-DNA：可以標(biāo)記互補(bǔ)探針捕獲靶標(biāo)探針結(jié)合的基因組DNA（高通量測序及Q-PCR）。

? ? ? ? ?四、案例分析

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? ? ? ? ?案例1：

? ? ? ? ?Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus（IF:12.109）

? ? ? ? 1、通過ChIRP技術(shù)獲取與EIciRNAs火族結(jié)合產(chǎn)物：包括protein-Pol II，RNA- U1 snRNP以及染色體基因的啟動(dòng)子片段；

? ? ? ? ?2、文章以HDAC2蛋白作為陰性對照組，以U7結(jié)合Lsm10為陽性組，檢測結(jié)合蛋白 Pol II、U1A 、 U1C 與 circRNA結(jié)合；

? ? ? ? 3、環(huán)狀RNA結(jié)合產(chǎn)物RNA驗(yàn)證以U7和5S rRNA為陰性對照，驗(yàn)證結(jié)合的U1snRNA；

? ? ? ? 4、結(jié)合富集的染色體DNA進(jìn)行驗(yàn)證檢測。

? ? ? ? 案例2：

? ? ? ? LINC02273 drives breast cancer metastasis by epigenetically increasing AGR2 transcription（IF：10.679）

? ? ? ? 解析1：

? ? ? ? ? ? （1）作者在MDA-mb-231乳腺癌細(xì)胞總建立 LINC02273 野生型和KO細(xì)胞株；

? ? ? ? ? ? （2）設(shè)計(jì)奇數(shù)組與偶數(shù)組進(jìn)行ChIRP實(shí)驗(yàn)，高通量測序獲取得到的RNA序列；

? ? ? ? ? ? （3）尋找野生型和KO細(xì)胞株測序?qū)ふ也町惐磉_(dá)基因；

? ? ? ? ? ? （4）野生型和KO組測序的差異表達(dá)基因與ChIRP測序獲取的信息進(jìn)行尋找潛在的靶標(biāo)分子。

? ? ? ? ?解析2：

? ? ? ? ?分析在染色體基因組野生型和KO組，以及經(jīng)過ChIRP純化獲取的DNA信息，尋找靶標(biāo)染色體DNA。

? ? ? ? ?結(jié)語：對于分子機(jī)制的深度挖掘，以多維度結(jié)合，在全細(xì)胞層次探究潛在的分子機(jī)制，提高文章研究深度。