? ? ? ?經(jīng)常會看到一些論文，明明做了很多的工作，卻沒有發(fā)到相應(yīng)檔次的雜志上， 看到這類的文章，我的感覺通常是非常的痛心。對于一個科研工作者來說，每個實(shí)驗(yàn)都是心血，論文就像是我們的孩子。每一個做家長的都想極力的挖掘孩子身上的潛力，從而讓孩子找到自己正確的位置，讓孩子的才能不被埋沒。那么如何才能讓自己辛辛苦苦做出的論文發(fā)在對應(yīng)檔次的雜志上呢？

? ? ? ?1、文章發(fā)表前，要多查閱目標(biāo)雜志的文章，從已經(jīng)發(fā)表的文章去評估雜志與自己論文的創(chuàng)新性，工作量等是否相匹配，進(jìn)而準(zhǔn)確判斷自己論文可以發(fā)表雜志的層次；

? ? ? ?2、在創(chuàng)新性，工作量相匹配的情況下，盡量優(yōu)先影響力較高的雜志進(jìn)行投稿；

? ? ? ?3、在被影響力較高的雜志拒稿后，若已經(jīng)被送審，則要仔細(xì)研讀審稿人的意見，看是否有可以顯著提高文章的檔次的意見；若被秒拒，則逐步降低投稿雜志的分值，雖然這種方法可能會比較費(fèi)時間，但能有效保證自己的論文不被埋沒；

? ? ? ?4、投稿前多向投稿經(jīng)驗(yàn)豐富的老師同學(xué)請教，投稿也是一個技術(shù)活，不同的人投稿結(jié)果也可能會截然不同；

? ? ? ?5、設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時盡量圍繞自己研究的核心進(jìn)行，避免文章的結(jié)構(gòu)太散。高分文章一般都是既有寬度又有深度的，但是個人認(rèn)為文章的深度對發(fā)表雜志的檔次起著決定性作用。

? ? ? ?接下來就從一篇來自多倫多大學(xué)萊斯利丹藥學(xué)院的文章開始講起“Genome-Wide CRISPR-Cas9 Screens Expose Genetic Vulnerabilities and Mechanisms of Temozolomide Sensitivity in Glioblastoma Stem Cells” 發(fā)表在Cell Reports雜志， 影響因子為7.815。個人認(rèn)為這篇文章的創(chuàng)新性，工作量等都是要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于這個層次的。

? ? ? ?首先看其創(chuàng)新性，這篇文章使用了比較前沿的技術(shù)-CRISPR/cas9全基因組文庫篩選GSCs特異性適應(yīng)度基因和TMZ耐藥基因和敏感基因；結(jié)合干細(xì)胞，TMZ耐藥性和敏感性， CRISPR/cas9等研究熱點(diǎn)于一體，通過與人胎兒神經(jīng)干細(xì)胞和其他來源腫瘤細(xì)胞進(jìn)行對比，篩選出了GSCs特異性適應(yīng)度基因，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)巧妙，嚴(yán)謹(jǐn)，合理，有很強(qiáng)的創(chuàng)新性。

? ? ? ?? 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）是成年人最常見的原發(fā)性惡性腦腫瘤。患者間和患者內(nèi)的腫瘤異質(zhì)性以及對治療完全缺乏持久的反應(yīng)可能是導(dǎo)致總體預(yù)后不佳的關(guān)鍵因素。替莫唑胺(TMZ)化療是GBM治療的最后的重大進(jìn)展，但它的療效非常有限，它可以引起腫瘤細(xì)胞額外的突變，可能最終導(dǎo)致疾病的進(jìn)展。雖然人類GBM腫瘤樣本的大規(guī)模基因組分析揭示了復(fù)雜的基因組結(jié)構(gòu)，但這些變化很難與GBM生長和功能細(xì)胞特性相聯(lián)系。事實(shí)上，我們需要更全面地了解這種異種癌癥的生長和藥物反應(yīng)的分子決定因素，以確定新的潛在治療方法，并提供可以與TMZ合作的新策略，目前TMZ已經(jīng)在前期GBM治療中得到了鞏固。

? ? ? ?? GBM的生長被認(rèn)為是由一小群GBM干細(xì)胞(GSCs)驅(qū)動的，GSCs具有自我更新和產(chǎn)生子代的能力，并且表達(dá)更多的分化標(biāo)記物和更有限的致瘤能力。最近的單細(xì)胞RNA測序(RNA-seq)方法和新鮮人GBM細(xì)胞的體內(nèi)脂肪定位研究支持了這一觀點(diǎn)，這也強(qiáng)調(diào)了化療耐藥致瘤亞群的存在。雖然GSC的致瘤特性在體內(nèi)得到了最好的驗(yàn)證，但GSC培養(yǎng)系統(tǒng)已經(jīng)使這些來自許多GBM樣本的患者來源的細(xì)胞能夠在體內(nèi)進(jìn)行難以實(shí)現(xiàn)的功能實(shí)驗(yàn)。重要的是，這些GSC培養(yǎng)物可靠地保留了患者的特異性表型和基因型特征，包括在單個克隆水平上，保留體內(nèi)的致瘤能力和對分級生長行為的再現(xiàn)。

? ? ? ?? CRISPR-CAS9技術(shù)的出現(xiàn)使得包括“細(xì)胞適應(yīng)度”在內(nèi)的一系列基因篩選成為可能，它允許系統(tǒng)地識別“核心”和“特定環(huán)境”的基本/適應(yīng)基因，這些基因控制著所有細(xì)胞類型或特定細(xì)胞遺傳背景下的細(xì)胞增殖。特定環(huán)境的適應(yīng)度基因代表了獨(dú)特的遺傳弱點(diǎn)，這是合成致死率概念的基礎(chǔ)，在某些情況下，可能被用于治療。

? ? ? ?接著看下這篇文章的工作量，該文章中共做了18株細(xì)胞的CRISPR/cas9全基因組文庫篩選，進(jìn)行了6株GSCs細(xì)胞的CRISPR/cas9全基因組文庫耐藥性篩選和敏感性篩選，對篩選獲得的各個關(guān)鍵基因都做了一定程度的功能性驗(yàn)證。就工作量來說，足以能達(dá)到發(fā)表10-20文章的層次。

? ? ? ?考慮到GBM中觀察到的復(fù)雜的患者間異質(zhì)性，需要多個適應(yīng)度篩選來捕獲所有患者之間共同的遺傳依賴關(guān)系和GBM各基因型特有的遺傳依賴關(guān)系。在這篇文章中，作者在10個低傳代病人來源的GSC培養(yǎng)中進(jìn)行了平行的全基因組CRISPR篩選，這些培養(yǎng)中包含了一系列典型的GBM基因組異常，與他們的原發(fā)腫瘤相匹配，以確定控制GSC生長和生存的分子回路。對兩種正常的人胎兒神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行平行篩選，與假定的來源細(xì)胞進(jìn)行比較，并分析GBM的特異性弱點(diǎn)。同時，作者對GSCs進(jìn)行了化學(xué)基因組篩選，以識別調(diào)節(jié)TMZ反應(yīng)性的基因，揭示治療抗性的機(jī)制和組合治療的策略。

壹

? ? ? ?作者通過8株GSCs， 8株非GSCs 和2株胎兒神經(jīng)干細(xì)胞系進(jìn)行CRISPR/ cas9文庫篩選鑒定出了GSCs的遺傳易感性。

? ? ? ?篩選流程如下：

? ? ? ?結(jié)果顯示：

? ? ? ?1.鑒定出的適應(yīng)性基因的無監(jiān)督聚類揭示了GSCs與NSCs和RPE1從非CNS癌細(xì)胞中分離出來的分組，強(qiáng)調(diào)了這種癌癥類型與來自共同神經(jīng)發(fā)育譜系的細(xì)胞具有共同控制生長和生存的環(huán)境特異性機(jī)制。

? ? ? ?2.區(qū)分“譜系特異性”適應(yīng)性基因(GSCs和NSCs共有)和在轉(zhuǎn)化或腫瘤進(jìn)化過程中產(chǎn)生的GSC特異性適應(yīng)性基因

? ? ? ?3.GBM特異性癌癥適應(yīng)性基因的富集圖譜揭示了一系列網(wǎng)絡(luò)中的遺傳缺陷，包括染色質(zhì)組織和DNA修復(fù)、細(xì)胞命運(yùn)和膠質(zhì)形成、膽固醇生物合成、DNA復(fù)制和細(xì)胞周期、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)應(yīng)激和蛋白質(zhì)異常修飾。

? ? ? ?4.將獲得的GSC特異性適應(yīng)性基因敲除后， 細(xì)胞的競爭細(xì)胞增殖能力會顯著降低。

貳

? ? ? ?GSCs和NSCs有重疊但不同的控制干細(xì)胞和細(xì)胞適應(yīng)度的遺傳程序。

? ? ? ?結(jié)果顯示：

? ? ? ?1.將篩選結(jié)果與最近報(bào)道的31個血清生長的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系和2個GSCs的篩選結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)適應(yīng)性基因有重疊，但存在一些關(guān)鍵差異。

? ? ? ?2.將差異最大的兩個基因SOX2和SOX9敲除后，GSCs細(xì)胞適應(yīng)度也隨之降低。NSCs的結(jié)果表明，SOX2是GSCs和NSCs之間共享的適應(yīng)性基因，SOX9在GSCs中特別重要。

? ? ? ?3.另外一個GSC適應(yīng)性基因是泛素羧基末端水解酶USP8，它以前與生長因子受體的循環(huán)有關(guān)，但在NSC的兩個篩選中都沒有發(fā)現(xiàn)。考慮到GBM中EGFR信號的普遍解除管制，我們利用了一種工程泛素變體(Ubv8)，該變體之前被認(rèn)為是一種高度特異性和強(qiáng)效的USP8抑制劑，Ubv8的慢病毒表達(dá)導(dǎo)致了兩種GSC細(xì)胞系中細(xì)胞活力的顯著降低，而在NSC細(xì)胞系中則沒有這種現(xiàn)象。

叁

? ? ? ?作者通過一系列的分析篩選，SOCS3在GBM特異性適應(yīng)性得分最高，且該基因已被證明可維持NSCs的干細(xì)胞干性，因此對SOCS3敲除的GSCs細(xì)胞進(jìn)行測序，研究GBM特異性適應(yīng)性的調(diào)控機(jī)制。

肆

? ? ? ?組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶DOT1L調(diào)節(jié)GSCs的干性和增殖。

? ? ? ?1．與大部分腫瘤相比，H3K79甲基轉(zhuǎn)移酶DOT1L在GSC中高度表達(dá)，是7種GSC培養(yǎng)的適應(yīng)性基因，支持GSC的基本功能。

? ? ? ?2. 使用EPZ-5676抑制DOT1L21天后，可以抑制GSCs的增殖，促進(jìn)其細(xì)胞凋亡。

? ? ? ?3. EPZ-5676處理7天BT67 GSCs中神經(jīng)元分化標(biāo)記物(TUBB3和NEUROD1)和星形細(xì)胞分化標(biāo)記物(GFAP)的基因表達(dá)增加， 細(xì)胞干性基因表達(dá)減少，細(xì)胞的成球能力降低。

? ? ? ?4. EPZ-5676處理會導(dǎo)致H3K79me2標(biāo)記的廣泛丟失，包括NSC關(guān)鍵調(diào)控基因和GBM適應(yīng)度基因SOX2和OLIG2。

? ? ? ?5. EPZ-5676穿過血腦屏障的能力較差，因此作者在體外對兩種GSC培養(yǎng)物進(jìn)行預(yù)處理，然后進(jìn)行原位移植。接受過EPZ-5676預(yù)處理的腫瘤細(xì)胞接種動物后腫瘤生長速度降低，生存時間延長。

? ? ? ?6. 此外，在皮下模型中，給小鼠服用EPZ-5676導(dǎo)致H3K79me2標(biāo)記消失，并增加了與分化相關(guān)的基因的表達(dá)。

伍

? ? ? ?細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)通路的調(diào)節(jié)因子在GSCs中至關(guān)重要。

? ? ? ?1. CRISPR/cas9庫篩的結(jié)果顯示高水平的GBM特異性適應(yīng)度基因在應(yīng)激反應(yīng)途徑中的類泛素化修飾中也具有豐富的功能。單獨(dú)敲除類泛素化相關(guān)基因后，細(xì)胞的適應(yīng)性會顯著降低。

? ? ? ?2. 敲除UFC1和UFSP2后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白CHOP表達(dá)上調(diào)。

陸

? ? ? ?TMZ治療效果差，易發(fā)生誘變。為了提高TMZ的臨床療效，我們需要了解TMZ耐藥的遺傳機(jī)制，從而為制定該標(biāo)準(zhǔn)的治療組合提供依據(jù)。作者通過用TMZ 的LD20和LD90全基因組篩選揭示了TMZ在GSCs中的敏感性機(jī)制。

? ? ? ?1.使用 LD90 TMZ處理轉(zhuǎn)染文庫的細(xì)胞后，富集到了錯配修復(fù)MMR相關(guān)的核心成員， MLH1, MSH2, MSH6和PMS2四個基因， 將MLH1, MSH2敲除后，細(xì)胞的增殖力升高；

? ? ? ?2.為了確定GSC人群對TMZ的內(nèi)在抗性機(jī)制，我們在存在TMZ亞致死劑量的情況下進(jìn)行了陰性篩選(LD20)，使用 LD20 TMZ處理轉(zhuǎn)染文庫的細(xì)胞后，6組細(xì)胞有4組細(xì)胞顯示出TMZ敏感的核心基因集。這四種培養(yǎng)物對應(yīng)的株系表現(xiàn)出一定程度的TMZ敏感性，而其余兩種培養(yǎng)物表現(xiàn)出TMZ耐藥。

? ? ? ?3.GO分析和蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析顯示基因和蛋白網(wǎng)絡(luò)參與多種DNA修復(fù)途徑。

? ? ? ?4.MCM8和MCM9在本研究的多個TMZ化學(xué)基因組篩檢中被認(rèn)為是最熱門的蛋白，它們共同形成了參與同源重組的二聚體解旋酶復(fù)合物。敲除MCM8或MCM9對未處理細(xì)胞的適應(yīng)度無顯著影響，但GSC對TMZ的敏感性較強(qiáng)，對NSCs的影響較小。

? ? ? ?5.低劑量TMZ處理GSCs可導(dǎo)致雙鏈斷裂，在表達(dá)非靶向gRNA的細(xì)胞中迅速修復(fù)，而表達(dá)靶向MCM8和MCM9的gRNAs的細(xì)胞則表現(xiàn)出持久的γH2AX，這是DNA修復(fù)缺陷的一個標(biāo)志。

? ? ? ?6.大量完全未鑒定的基因也被鑒定為介導(dǎo)GSCs內(nèi)源性TMZ耐藥的基因。C17orf53和ZC3H7A分別在至少三種GSC培養(yǎng)基中被鑒定為hit。

? ? ? ?7.鋅指基因ZC3H7A敲除或過表達(dá)分別導(dǎo)致TMZ敏感性和抗性增加。

? ? ? ?8.為了測定ZC3H7A的作用，我們采用親和純化-質(zhì)譜法鑒定ZC3H7A相關(guān)蛋白。ZC3H7A的近端相互作用體被富集，參與調(diào)控翻譯、mRNA處理、細(xì)胞質(zhì)應(yīng)激顆粒和p53介導(dǎo)的DNA損傷信號等生物學(xué)過程。

? ? ? ?9.BioID實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)已知的應(yīng)激顆粒(UBAP2L, G3BP1)和RNA處理體(CNOT complex)蛋白與ZC3H7A相互作用，因此測試了ZC3H7A是否與這兩種結(jié)構(gòu)的標(biāo)記物共域化。亞砷酸鈉處理后，ZC3H7A定位于與應(yīng)激顆粒標(biāo)記物G3BP1共定位的細(xì)胞質(zhì)顆粒。

? ? ? ?最后講一下個人感覺這篇文章可以改進(jìn)的地方：

? ? ? ?? 該篇文章涉及的內(nèi)容比較多，GSCs特異性適應(yīng)度基因，GSCs TMZ耐藥基因和敏感基因， 總共涉及到了11個基因的功能， 但這些基因的功能都是只做了簡單的表型研究，未做深入的機(jī)制研究；

? ? ? ?? 涉及的11個基因其中會有或多或少的相互聯(lián)系，但該文章均沒有將其串在一起，沒有形成系統(tǒng)的故事；

? ? ? ?? 如果是我的話，我可能會把GSCs特異性適應(yīng)度基因和GSCs TMZ耐藥基因，敏感基因分成兩篇文章，然后對其篩選出的基因進(jìn)行深入的調(diào)控機(jī)制研究，進(jìn)而繪制一張影響細(xì)胞特異性適應(yīng)度，耐藥性，敏感性的調(diào)控通路圖。