背景：

? ? ? 可變剪切(AS)是一種有效和普遍的轉錄調(diào)控機制，擴大了基因組的編碼能力，并與癌癥的發(fā)生和發(fā)展相關。目前對結直腸癌(CRC)的可變剪接進行系統(tǒng)的分析非常少，因此研究這個是非常有必要的。

思路：

? ? ? ?從TCGA數(shù)據(jù)庫下載RNA-seq數(shù)據(jù)和相應的臨床信息。然后，使用SpliceSeq來評估RNA剪接模式，并計算了 Percent Spliced In (PSI)值。根據(jù)PSI值比較CRC和癌旁的差異可變剪切事件（DEAS）。利用生物信息學方法進一步分析了DEAS及其剪接網(wǎng)絡。最后，采用Kaplan-Meier、Cox比例回歸和非監(jiān)督聚類分析方法，評價DEAS與患者臨床特征的關系。

結果：

? ? ? ?本研究共識別出34,334個AS，其中421個DEAS。這些DEAS的親本基因在調(diào)節(jié)蛋白激酶活性、PI3K-AKT信號通路和p53信號通路等CRC相關過程中發(fā)揮重要作用。有37個DEAS事件與OS有關，68個DEAS事件與DFS相關，其中AT（CXCL12）和RI（CSTF3）與OS和DFS均顯著相關。基于DEAS的無監(jiān)督聚類分析，顯示具有不同生存模式的4個類，并與一致的分子亞型相關。

結論：

? ? ? ?在CRC中，AS事件似乎存在很大的差異，這些差異可能是預后和生物學調(diào)控的重要決定因素。我們所鑒定的DEAS和剪接網(wǎng)絡對于揭示CRC中AS的潛在機制具有重要價值，并為進一步驗證治療靶點提供了線索。

? ? ? ?接下來，讓我們來看看作者具體是怎么做的吧~

一、可變剪切事件鑒定

? ? ? ?從TCGA中獲得627例CRC患者的RNA-seq數(shù)據(jù)，經(jīng)SpliceSeq分析，得到82,411 AS事件（13,201個基因）。根據(jù)剪接模式，這些事件大致可分為七種類型，包括外顯子跳躍(ES)、互斥外顯子(ME)、保留內(nèi)含子(RI、候補啟動子(AP)、候補終止子(AT)、替代供體位點(AD)和候補受體位點(AA)（圖a）。將AS事件進行兩步過濾：a)具有PSI值的樣本大于75%；b)PSI均值大于0.05。經(jīng)過濾后，剩余34,334 AS事件（8942個基因）。平均一個基因，有4個AS類型。

二、可變剪切事件差異分析

? ? ? ?用T檢驗比較了腫瘤樣本和正常人樣本的AS事件的PSI值，取|log2FC|>1且adj.P

? ? ? ?基于DEAS的無監(jiān)督的聚類分析，腫瘤樣本和正常人樣本被清楚地分為兩組（圖b），這表明以上鑒定的DEAS結果是可信的。DEAS可能直接影響其親本RNA的表達，特別是當AT或AP事件發(fā)生時。為了探討DEAS與差異表達基因(DEG)之間的關系，我們對DEG中發(fā)生的DEAS進行了分析（圖c）。如我們所料，影響親本RNA表達的DEAS，AT(44.4%)和AP(50.0%)占比94.4%。圖d是幾個基因的AS事件示意圖~

三、差異可變剪切富集及互作分析

? ? ? 已經(jīng)有證據(jù)表明AS可以通過一些機制直接影響蛋白質(zhì)功能。因此，對發(fā)生DEAS的親本基因進行了GO、KEGG富集分析。GO富集分析顯示，這些基因多與蛋白結合、細胞形態(tài)發(fā)生、GTPase調(diào)節(jié)活性和蛋白激酶活性有關。KEGG富集分析顯示，這些基因多富集在PI3K-Akt信號通路、p53信號通路、NF-kb信號通路等癌癥相關通路中。上述結果表明DEAS的親本基因在調(diào)節(jié)CRC相關生物學過程中起著重要作用。而這些基因轉錄體結構的變化必然會影響其蛋白翻譯，并進一步修飾其蛋白質(zhì)特征。因此，有必要從蛋白質(zhì)網(wǎng)絡的角度對這些事件進行研究。基于DEAS相關基因的PPI網(wǎng)絡分析不僅顯示了正常狀態(tài)下的交互關系，而且揭示了AS事件對整個網(wǎng)絡的潛在影響。

四、剪切因子與DEAS相關性網(wǎng)絡

? ? ? ?由于AS事件主要由剪接因子調(diào)控，這些剪接因子與前mRNAs結合，影響外顯子的選擇和剪接位點的選擇，更重要的是，腫瘤微環(huán)境中的DEAS可能是由幾個關鍵的剪接因子引起的。本研究通過文獻和數(shù)據(jù)庫的手工篩選，確定了71個剪接因子，這些剪接因子都在先前的研究中進行了實驗驗證。我們從TCGA數(shù)據(jù)庫中，找到了這些剪接因子的表達數(shù)據(jù)。然后，將71個剪接因子的表達水平與每個DEAS的PSI值進行相關性分析，并構建了剪切調(diào)控網(wǎng)絡（|R|>0.5，p

五、DEAS在大腸癌預后中的價值

? ? ? 對于每一種AS，我們根據(jù)PSI值將病人分為兩組，然后分別對OS和DFS進行單變量生存分析，結果發(fā)現(xiàn)總共37個DEAS事件與OS相關，68個DEAS事件與DFS相關。圖a展示了同時與OS和DFS顯著相關的DEAS。單因素分析中與生存率顯著相關的DEAS通過多因素分析進一步評估，以確定CRC的獨立預后指標，結果發(fā)現(xiàn)，有4個OS獨立預后指標，11個DFS獨立預后指標（圖b）。并且AT（CXCL12）和RI（CSTF3）可以作為大腸癌OS和DFS的獨立預后指標。

? ? ? ?AT（CXCL12）和RI（CSTF3）根據(jù)PSI值分組患者在OS和DFS存活分析中均形成了顯著的Kaplan-Meier曲線（圖ab）。以上結果說明DEAS不僅具有重要的生物學意義，而且具有潛在的臨床價值。

六、與預后和分子亞型相關的AS簇

? ? ? 我們的研究結果表明，每種DEAS在個體水平上的表達差異很大，部分反映了CRC患者的預后。因此我們思考通過對所有樣本進行無監(jiān)督的聚類，是否可以根據(jù)421的DEAS來識別出不同的AS模式。通過結合用肘子法（Elbow method）和Gap statistic，我們確定了分類數(shù)k=4（圖a，b）。臨床數(shù)據(jù)和突變數(shù)據(jù)與聚類結果一起展示在圖c，我們發(fā)現(xiàn)不同的CMS、TNM分期、KRASm和生存狀態(tài)(OS和DFS) 的CRC樣本在集群間中的分布不是隨機的。例如，歸類為C3的腫瘤樣本有更頻繁的KRAS突變和富集的CMS4和晚期TNM分期。作為CRC的先前定義的共識分子亞型，CMS4已被證明包括更多的間充質(zhì)樣癌癥，具有高的基質(zhì)浸潤和較差的患者預后。因此，我們進行了Kaplan-Meier分析，以評估聚類和預后之間的關系。結果表明，聚類與不同的預后顯著相關，其中C3的腫瘤樣本在OS和DFS分析中均與不良預后相關（圖d）。總的來說，這些發(fā)現(xiàn)表明，CRC的AS有相當大的差異，部分是由原發(fā)性腫瘤的分子特征決定，進而影響了臨床結果。

? ? ? RNA_seq、差異分析、GO、KEGG、PPI、相關性分析、生存分析、聚類分析……這些超級常見的生信分析方法，加上了可變剪切，立馬身價倍增，你值得擁有！