一、背景

? ?PD-1檢查點封鎖的免疫療法雖然顯著，但療效依然無法持續(xù)，仍需要尋找新的免疫治療靶標(biāo)協(xié)同治療。在這里，作者以CRISPR-Cas9基因組編輯技術(shù)作為篩選方法，在免疫療法治療的荷瘤小鼠體內(nèi)篩選基因，篩選與檢查點封鎖（PD1-PDL1）協(xié)同作用或?qū)z查點封鎖耐藥的基因并做了驗證。

二、研究結(jié)果

? ?作者首先構(gòu)建B16黑色素瘤細胞系穩(wěn)轉(zhuǎn)表達Cas9（補充圖1a），并驗證了靶向PD-L1的小向?qū)NA（sgRNA）有效編輯（補充圖1g）。

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補充圖1a和1g

??作者用黑色素瘤細胞高表達的2368個基因作為CRISPR-Cas9庫篩選靶標(biāo)，構(gòu)建慢病毒敲除（KO）文庫，該庫編碼9872個sgRNA，靶向2368個基因，并且，這些基因在腫瘤細胞系中的表達水平足以被檢測到（補充圖1b）。

補充圖1b

? 腫瘤細胞體外進行基因編輯后，移植到動物體內(nèi)，用分泌粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）的放射線照射的腫瘤細胞疫苗（GVAX）單獨治療、使用針對PD-1的抗體單獨治療、GVAX與PD-1抗體結(jié)合治療，以產(chǎn)生對腫瘤細胞足夠的免疫選擇壓力（圖1b和補充圖1c）。同時，將經(jīng)文庫轉(zhuǎn)導(dǎo)的腫瘤細胞移植到缺乏CD4 +和CD8 +T細胞的Tcra - / -小鼠中（無法在腫瘤上施加適應(yīng)性免疫的選擇壓力）。在12-14天后，收集了腫瘤（圖1b和補充圖1c），并將免疫治療后的野生型動物的腫瘤中的文庫表示與在Tcra - / -小鼠中生長的腫瘤進行了比較。這一步，驗證了Tcra - / -小鼠對腫瘤沒有適應(yīng)性免疫選擇壓力，說明Tcra - / -小鼠適合用做體內(nèi)篩選模型的對照組。

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圖1a、1b和補充圖c

? 在12-14天后，將免疫治療后的野生型動物的腫瘤中的文庫表示與在Tcra - / -小鼠中生長的腫瘤進行了比較（補充圖1d–f，h）。用免疫療法治療腫瘤中被耗竭的sgRNA靶向的基因中出現(xiàn)了已知的免疫逃逸分子PD-L1，這表明PD-L1的敲除增加了腫瘤細胞對免疫攻擊的敏感性。

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補充圖1d–f，h

? ? ?Tcra - / - VS in vitro顯示，靶向PD-L1的sgRNA在Tcra - / -的腫瘤中沒有耗竭，這可能是因為Tcra - / -缺乏T細胞介導(dǎo)的免疫選擇壓力（圖1c）。而在接受GVAX治療的野生型荷瘤小鼠中，這些基因卻比Tcra - /- 型小鼠顯著耗竭了（錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）= 0.004）。但是，在用GVAX聯(lián)合抗PD-1治療的腫瘤中靶向PD-L1的sgRNA沒有耗竭，這表明當(dāng)阻礙PD-L1-PD-1相互作用，PD-L1的治療沒有選擇壓力（圖1c）。

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圖1c、1d和補充圖1g

? ? ??用GVAX或GVAX和PD-1阻斷劑治療的腫瘤中，靶向CD47（高表達的CD47到表面的細胞會被巨噬細胞當(dāng)作“正常細胞”實現(xiàn)免疫逃逸）的sgRNA 明顯減少（分別為FDR = 0.005，F(xiàn)DR = 0.002） （圖1d和補充圖1g）。為了證實CD47無功能的腫瘤更易受GVAX和PD-1阻滯，作者使用Cas9-sgRNA質(zhì)粒的瞬時轉(zhuǎn)染制備了CD47無功能的B16黑色素瘤細胞（補充圖2a），發(fā)現(xiàn)CD47的丟失明顯提高了GVAX和抗PD-1免疫療法介導(dǎo)的腫瘤生長的抑制（補充圖2b，P?

補充圖2e~g

1、增強免疫療法功效的基因靶標(biāo)

? ?在免疫療法治療的小鼠中的50個最耗盡的基因中（全部FDR

圖2：KO篩選有助發(fā)現(xiàn)新的免疫療法靶標(biāo)

? 根據(jù)STARS算法最高累積得分排名，從這四個組中分別選擇了一個代表基因進行驗證：Ptpn2（一種磷酸化酶）、H2-T23（非經(jīng)典的MHC-1基因）、Ripk1（調(diào)節(jié)細胞死亡和炎癥的激酶）、STUB1（參與未折疊蛋白應(yīng)答的調(diào)節(jié)的E3泛素連接酶）。體內(nèi)競爭試驗表明，在免疫療法治療的動物中，針對四個基因中任意一個基因敲除的腫瘤細胞都有顯著的生長優(yōu)勢，但是在體外和Tcra- / -小鼠中，它們的生長速率與控制腫瘤細胞的速率相同。（圖2b，c）。這表明這些基因功能的喪失使腫瘤細胞對免疫療法更加敏感（在沒有T細胞的情況下，這些基因功能喪失的腫瘤生長正常）。

? ?H2-T23編碼Qa-1b（人類中的HLA-E），這是一種非經(jīng)典的MHC分子，與T細胞和自然殺傷（NK）細胞上的抑制性受體NKG2A結(jié)合。通過比較B16黑色素瘤H2- T23-敲除細胞的生長（圖4g），發(fā)現(xiàn)Qa-1b功能的喪失增強了免疫療法療效。對照腫瘤的免疫療法僅根除10個腫瘤中的1個，H2-T23敲除腫瘤的免疫療法在所有10只動物中均治愈（圖2d，e；P ?

2、腫瘤敲除Ptpn2后，對免疫治療更敏感

? ?在體內(nèi)競爭試驗中，觀察免疫療法對 Ptpn2功能敲除的腫瘤療效，Ptpn2- null的腫瘤對免疫治療的敏感性顯著更高（圖3a）。在沒有T細胞或沒有免疫療法的情況下，Ptpn2功能敲除的腫瘤細胞在體內(nèi)沒有生長不利的條件（見原文補充圖5a–d）。在T細胞免疫型Braf / Pten基因的黑素瘤模型（圖3b和補充圖4F。）、MC38結(jié)腸癌模型（補充圖5）中PTPN2的損失也增加了免疫治療的靈敏度。因此，腫瘤敲除Ptpn2后，對免疫治療更敏感。

圖3：腫瘤敲除Ptpn2后，對免疫治療更敏感

? 在敲除 Ptpn2的腫瘤細胞中的重新表達PTPN2（即Ptpn2恢復(fù)試驗），解除了對免疫療法的敏感性（圖3c，d），排除了基因編輯的脫靶作用增加對免疫療法敏感性的可能。此外，過表達PTPN2的B16腫瘤細胞在免疫療法治療的小鼠中腫瘤增加（圖3c，d），這表明增加PTPN2 表達恢復(fù)了腫瘤細胞對免疫療法的抗性。

? 為了確定PTPN2擴增是否與人類癌癥的免疫治療抗性相關(guān)，作者檢查了接受PD-1，PD-L1或CTLA-4阻斷治療患者的外顯子組測序數(shù)據(jù)。在20例患者中發(fā)生PTPN2擴增，但是這些事件大多數(shù)是染色體水平或臂水平擴增，僅在兩名患者中發(fā)生局灶性擴增，數(shù)量太少，無法確定PTPN2擴增是否是耐藥機制（補充圖6）。

補充圖6

Ptpn2丟失會增加腫瘤的抗原呈遞

? ?為了確定Ptpn2敲除增強免疫療法功效的機制，作者用流式比較了對照和Ptpn2- null腫瘤的腫瘤微環(huán)境中免疫細胞亞群的組成。相對于野生型腫瘤， CD45 +細胞，NK細胞，CD4 + T細胞，F(xiàn)oxP3 +調(diào)節(jié)性T細胞或Ptpn2-敲除腫瘤細胞中髓樣區(qū)的總數(shù)沒有差異（圖4a和補充圖7a-d，8a，b）。但是，Ptpn2- null腫瘤中CD8 +的數(shù)量明顯更多T細胞和γδ + T細胞（圖4a）。結(jié)合免疫組織化學(xué)染色證實，用免疫療法治療的CD8α +細胞數(shù)量增加了三倍，這些細胞彌漫性浸潤了Ptpn2敲除型腫瘤（圖4b）。進一步的流式分析，Ptpn2敲除的腫瘤含有表達粒酶B 的CD8 + T細胞比例增加（圖4c）。因此，Ptpn2敲除增加了腫瘤中活化的細胞毒性CD8 + T細胞的數(shù)量。

圖4：Ptpn2的敲除改善了抗原呈遞和T細胞刺激

? ? ? 為了測試Ptpn2陰性腫瘤中細胞毒性CD8 + T細胞數(shù)量的增加是否是通過增加抗原呈遞而提高了對腫瘤細胞的識別。作者在Ptpn2 - null或?qū)φ誃16細胞中表達了全長卵清蛋白（OVA ）抗原。發(fā)現(xiàn)Ptpn2-敲除細胞中對OVA抗原的SIINFEKL-H2Kb表位的單抗染色更多，這表明Ptpn2的敲除增加了腫瘤細胞表面上載有抗原的MHC-1的水平（圖4d）。此外，Ptpn2與對照細胞相比，敲除細胞在用IFNγ處理后總MHC-1 ?含量增加（補充圖9a）。

? ? ? ?為了測試Ptpn2的敲除是否使腫瘤細胞更易于識別為T細胞，作者用識別SIINFEKL表位的OT-1 CD8 + T細胞與表達OVA的Ptpn2 – null和對照細胞共培養(yǎng)。通過細胞內(nèi)IFNγ和TNF染色發(fā)現(xiàn)，用Ptpn2-敲除的OVA-B16 細胞培養(yǎng)的T細胞的活化明顯更高（圖4e）。為了測試Ptpn2- null腫瘤細胞是否對T細胞更敏感，作者將表達OVA的Ptpn2 - null或野生型B16細胞與抗原特異性CD8 + T細胞混合培養(yǎng)了六天，發(fā)現(xiàn)缺乏Ptpn2的腫瘤細胞存在比例下降（圖4f）。因此，腫瘤細胞中Ptpn2的敲除增加了抗原呈遞和對細胞毒性CD8 + T細胞的敏感性。

3、Ptpn2的敲除會增加腫瘤細胞對IFNγ的敏感性

? ? ? 根據(jù)先前報道，PTPN2通路與IFNγ有關(guān)，作者分析了響應(yīng)IFNγ刺激的Ptpn2敲除細胞中的STAT1活性。在用IFNγ處理后，Ptpn2-敲除的B16細胞顯示磷酸化的p-STAT1增加，而Ptpn2的過表達抑制了該磷酸化（圖5a）。對IFNγ、TNF或兩者處理的Ptpn2敲除和對照B16腫瘤細胞做轉(zhuǎn)錄分析，發(fā)現(xiàn)Ptpn2的敲除會導(dǎo)致IFNγ處理后IFNγ響應(yīng)基因的表達譜發(fā)生顯著變化，但在未刺激的條件下不會改變基因表達，僅在TNF刺激后（圖5b）。在四種PTPN2的功能喪失的人類腫瘤細胞系中，IFNγ刺激后，IFNγ反應(yīng)基因的表達也增加（圖5c；FDR

圖5a~c：Ptpn2的敲除增加腫瘤對IFNγ敏感性

? ?細胞周期調(diào)節(jié)劑（例如Cdkn1a）和一些參與凋亡的基因（例如Casp4，Casp8，Ifit2，Ripk1和Bak1）在用細胞因子處理的Ptpn2敲除腫瘤細胞中相對于野生型腫瘤細胞顯著上調(diào)。與這一發(fā)現(xiàn)一致的是，單獨或與IFNβ或TNF聯(lián)合使用IFNγ后，會顯著降低Ptpn2- null小鼠腫瘤細胞系（圖5d）和人的腫瘤細胞系腫瘤生長（相對于野生型）（圖5e）。這些結(jié)果表明，單獨使用IFNγ足以抑制Ptpn2 / PTPN2敲除小鼠和人類腫瘤細胞生長。

圖5d和圖5e Ptpn2的敲除增加腫瘤對IFNγ敏感性

4、Ptpn2敲除提高了免疫療法的療效，依賴IFNγ通路

? ? ? 為了確定Ptpn2敲除細胞對免疫治療敏感性提高的機制是否取決于IFNγ信號傳導(dǎo)，作者制備了Ptpn2敲除，Stat1，Jak1，Ifngr1或Ifnar2也已被剔除的B16腫瘤細胞系（圖5f）。

圖5f，g，h

? GVAX和抗PD-1免疫療法治療的動物中測試了這些雙敲除細胞相對于僅敲除Stat1，Jak1，Ifngr1或Ifnar2的腫瘤細胞的生長。Ptpn2單獨敲除的腫瘤生長處于劣勢（圖5g，h），符合預(yù)期。同時敲除IFNγ下游任何一個基因，都會使原來生長不利的Ptpn2- null細胞（0.1%）恢復(fù)生長比例（11%）（圖5g，h）。Ifnar2（一種檢測I型干擾素的基因）的丟失并沒有消除Ptpn2- null腫瘤對GVAX和抗PD-1免疫療法的敏感性（圖5h）。該遺傳上位實驗（genetic epistasis experiment）表明，在無法響應(yīng)IFNγ信號的腫瘤細胞中，Ptpn2缺乏不能使腫瘤細胞對免疫療法敏感。因此，Ptpn2敲除使腫瘤細胞對免疫療法是否敏感，取決于對IFNγ的通路響應(yīng)。

三、結(jié)論

? 作者利用CRISPR-Cas9編輯庫在體內(nèi)做了KO的遺傳基因篩選，為免疫腫瘤靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)提供了一種新方法。篩選出已知的免疫逃逸分子PD-L1和CD47，并發(fā)現(xiàn)干擾素-γ信號傳導(dǎo)的敲除引起了對免疫療法耐藥的機制。敲除腫瘤的NF-κB信號傳導(dǎo)、抗原呈遞和未折疊的蛋白質(zhì)反應(yīng)等基因，可以提高免疫療法的療效。此外，腫瘤細胞中蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶PTPN2的功能敲除提高了免疫療法的療效，主要是通過增強IFN-γ介導(dǎo)的對抗原呈遞和生長抑制這兩個信號通路實現(xiàn)的。