一、概述

? ?成骨分化是骨生成的關(guān)鍵步驟，即骨髓間充質(zhì)干細胞經(jīng)歷骨原細胞、成骨細胞最終分化為骨細胞的一個復(fù)雜的過程，其中涉及到多種類型細胞間和細胞內(nèi)的信號傳遞，如信號通路、轉(zhuǎn)錄因子、生長因子、 MicroRNA 等，形成了一個完整的骨代謝調(diào)控負反饋環(huán)路[1]。成骨分化最基本的生物學(xué)特征是骨基質(zhì)合成、分泌、礦化及成熟。

? ?骨基質(zhì)是鈣化的細胞間質(zhì)，包括有機質(zhì)和無機質(zhì)兩種成分。有機質(zhì)的主要成分是骨膠原纖維即骨膠原(bone collagen)，由成骨細胞合成，主要由Ⅰ型膠原蛋白組成，另有一類是被稱為無定形基質(zhì)(ground substance)的非膠原蛋白，如骨鈣素（OCN）、堿性磷酸酶（ALP）、骨橋蛋白（OPN）、骨結(jié)合素（ON）、骨唾液酸蛋白（BSP）、骨生長調(diào)節(jié)因子等。骨基質(zhì)中的無機質(zhì)為無機鹽，按含量多少依次是磷酸鈣、碳酸鈣、檸檬酸鈣，它們主要以羥基磷灰石的結(jié)晶形式分布于骨的有機質(zhì)中。無定形的磷酸鈣發(fā)展為羥基磷灰石結(jié)晶埋于骨的有機質(zhì)間隙中的過程，通常稱為骨礦化(bone mineralization)。

? ?Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runx2）和Sp1轉(zhuǎn)錄家族成員Osterix/Sp7被認(rèn)為是成骨分化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點[2]。Runx2促進成軟骨細胞和成骨細胞表達的主要胞外基質(zhì)（包括ALP、OPN、OCN、BSP 、I型膠原和X型膠原）的表達[3，4]，而且能夠激活Osterix/Sp7表達[5]。Osterix/Sp7也驅(qū)動成骨細胞表達外基質(zhì)，包括I型膠原、ALP、OC、OPN、BSP和OCN[6，7]。

二、成骨分化相關(guān)信號通路

1、BMP-Smads 信號通路

? ?BMPs 在骨代謝過程中起著關(guān)鍵性的調(diào)控作用。BMPs 屬于轉(zhuǎn)化生長因子 β (TGF-β)超家族，是一類多效性細胞因子，根據(jù)序列相似性和功能可以將 BMPs 分為4個亞族：BMP-2和BMP-4，BMP-5、-6、-7、-8a 和-8b，BMP-9和BMP-10，BMP-3、-3b、-11、-12、-13、-14、-15 和-16。其中，BMP-2、-7、-6、-9 能夠促進骨質(zhì)形成[8]，而 BMP-3 對成骨具有負調(diào)控作用[9]。TGF-β 超家族的成員均通過結(jié)合雙受體系統(tǒng)——I型和II型跨膜絲氨酸/蘇氨酸激酶受體(BMPR-I、BMPR-II)介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。而在膜信號傳入核內(nèi)的過程中，Smad 信號通路發(fā)揮著主要作用。

? ?BMP 信號分子結(jié)合并激活 BMPR-II，使BMPR-I 磷酸化并進一步磷酸化BMP 活化型 Smads（BR-Smads，為Smad1、5、8）的 C 末端 DNA 結(jié)合域，磷酸化的BR-Smads 與共同通路型Smads（Co-Smads，為Smad4）結(jié)合形成異質(zhì)低聚體進入核內(nèi)與轉(zhuǎn)錄因子相互作用（如圖1所示），共同激活成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子（Runx2、 Sp7等）表達，從而誘導(dǎo) MSCs 向成骨細胞分化及骨形成 [10-12]。在骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)中 BR-Smads 又可以與 Runx2 以物理結(jié)合的方式進一步誘導(dǎo)成骨分化[13]。BMP-Smads 信號通路上調(diào)Msx2表達，而Msx2促進Osterix/Sp7表達，這一過程不依賴Runx2[14]。I-Smads可以抑制 BR-Smads 和Co-Smads 的作用。此外，Samds 的活性還受到許多因素的調(diào)控。小C端結(jié)構(gòu)域磷酸酶1、2 (SCP-1、 SCP-2)介導(dǎo) Smads 的去磷酸化可抑制后者的轉(zhuǎn)錄活性[15]。E3泛素連接酶1（Smurf1）使 Smad1、 5泛素化而被 26S 蛋白酶體識別和降解[16]，Smurf2僅介導(dǎo)Smad1泛素化 [17]。

? ?此外BPM2信號促進E1A結(jié)合蛋白p300介導(dǎo)的Runx2乙酰化，而乙酰化增強Runx2的轉(zhuǎn)錄激活活性，并且抑制Smurf1介導(dǎo)的Runx2泛素化降解。HDAC4和HDAC5使Runx2去乙酰化，允許Runx2被Smurf1泛素化而降解[18]。

圖1??BMP-Smads 信號通路

2、Wnt/β-Catenin 信號通路

? ?Wnts是一類與卷曲蛋白受體（FZD）結(jié)合的分泌型糖蛋白。Wnt家族參與細胞極化、分化、遷移、增殖和生物學(xué)功能等多個細胞生理過程。Wnt 蛋白可以大致分為兩類：一類激活經(jīng)典的 Wnt信號通路，即 Wnt/β-Catenin 信號通路；另一類由Wnt5a 激活非經(jīng)典的Wnt通路，配體與FZD結(jié)合后不依賴于β-Catenin 和 LRP5/6。

? ? Wnt/β-Catenin經(jīng)典信號通路中，Wnt 配體與 FZD 或低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白 5/6 (LRP5/6)形成復(fù)合物。當(dāng)胞外缺乏Wnt蛋白時，該復(fù)合體無法形成，此時軸蛋白2（Axin2）、糖原合酶激酶 3β（GSK-3β）、大腸腺瘤樣蛋白（APC）、肌酸激酶1（CKMT1） 等組成復(fù)合體，該復(fù)合體可降解β-Catenin，胞漿及核內(nèi)的 β-Catenin水平降低，最終抑制Wnt/β-Catenin 信號通路；當(dāng) Wnt 分子與LRP5/6-FZD 受體復(fù)合體結(jié)合， LRP5/6 胞內(nèi)端磷酸化而產(chǎn)生軸蛋白 Axin2 的結(jié)合位點，Axin2 結(jié)合到該位點能抑制 GSK-3β介導(dǎo)的β-Catenin 水解，引起 β-Catenin 增加并進入核內(nèi)，與細胞核中的 T 細胞因子(TCF)/淋巴增強因子(LEF)轉(zhuǎn)錄復(fù)合物結(jié)合（如圖2所示），作為轉(zhuǎn)錄激活因子可引起下游靶基因表達，從而發(fā)揮調(diào)控作用[19]。

? ? 經(jīng)典Wnt信號通路在調(diào)節(jié)成骨細胞分化及骨形成方面是通過作用于Runx2起作用。Runx2 基因啟動子序列包含一個 TCF作用元件，它能將β-catenin 及 TCF1 募集到該位點，繼而啟動 Runx2及下游靶基因的表達，從而調(diào)節(jié)成骨細胞分化及骨形成[20]。此外LRP5 能通過上調(diào) Runx2及ALP的表達促進 MSCs 向成骨細胞分化，同時下調(diào) CCAAT 增強子結(jié)合蛋白 α 及過氧化物酶體增殖物激活受體 γ 的表達來抑制脂肪形成[21]。

Wnt/β-Catenin 信號通路

3、Notch 信號通路

? ?Notch 信號通路在進化上高度保守，其在細胞發(fā)育、增殖、凋亡和分化均具有調(diào)控作用。Notch 本身是一類在進化上高度保守的受體蛋白，在哺乳動物中 Notch 受體的同源分子有 4 種，分別為 Notch1、 2、 3、 4。配體同源分子目前已知有12種，根據(jù)結(jié)構(gòu)不同將 12 種配體分為四類。Notch 的受體和配體為跨膜蛋白，其發(fā)揮功能依賴于相鄰細胞間的相互接觸。

? ?當(dāng)相鄰細胞表面的同源配體與受體結(jié)合，Notch受體的胞外部分和跨膜部分分別經(jīng) TACE、 γ-分泌酶水解，引起 Notch 受體胞內(nèi)部分(NICD)從細胞膜上脫落并移入核內(nèi)。在細胞核中 NICD 與 RBPJ、 MAML相互作用，將轉(zhuǎn)錄抑制子轉(zhuǎn)化為激活子，激活下游 HES 家族、 HEY 家族等的基因表達[22]。

? ?NICD 過表達的 MC3T3-E1 細胞在成骨分化過程中鈣結(jié)節(jié)的形成量顯著增加，外源性 Notch 可以誘導(dǎo)多能間充質(zhì)細胞系(C3H10T1/2)成骨分化，抑制成脂分化[23]。Notch下游基因 Hes-1能與 Runx2 相互作用并增強后者作為轉(zhuǎn)錄激活子的活性，Notch 信號通路的激活子Maml 也能夠激活骨組織 Runx2 的轉(zhuǎn)錄[24]。Notch信號通路也通過轉(zhuǎn)錄激活Osterix /Sp7，以及上調(diào)細胞周期蛋白D 和周期蛋白 E 來實現(xiàn)的提高成骨細胞增殖能力[25]。

4、Hedgehog 信號通路

? ? Hedgehog 信號通路同樣在進化上高度保守，在發(fā)育和內(nèi)穩(wěn)態(tài)方面起著重要作用。Hedgehog是一類分泌型信號蛋白，在哺乳動物體內(nèi)可分為三類：Sonic Hedgehog (SHH), Indian Hedgehog (IHH), Desert Hedgehog (DHH)。當(dāng)胞外 Hedgehog 蛋白與跨膜受體(Ptch1)結(jié)合即解除對SMO抑制并進一步使之磷酸化，活化的 SMO與 Cos2、 Fu 結(jié)合形成復(fù)合物，該復(fù)合物可激活鋅指蛋白家族 Ci/G li，促使它們進入核內(nèi)聚集并激活轉(zhuǎn)錄，從而啟動下游靶基因表達[26]。

? ?SHH 能上調(diào)成骨細胞系Osterix /Sp7的表達，促進成骨細胞產(chǎn)生并間接上調(diào)破骨細胞的活力[27]。IHH通過Gli2上調(diào) Runx2 的表達來調(diào)控成骨細胞分化[28]。Ptch1缺陷的成骨前體細胞由于與Runx2 的反應(yīng)性增加及 GLI3 抑制物產(chǎn)生減少而表現(xiàn)為成骨分化速度增快[29]。?

5、MAPK 信號通路

? ?傳統(tǒng)的絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)包括三個亞家族成員：ERK1/2、 ERK5， JNK1/2/3， p38。MAPK 通路主要參與轉(zhuǎn)導(dǎo)胞外刺激(環(huán)境壓力、生長因子、細胞因子等)引起細胞生長、分化和凋亡。一旦細胞接觸刺激物， MAPKK 激酶(MAP3K)被激活并磷酸化 MAPK 激酶(MAP2K)，而后磷酸化激活MAPKs [30]。

? ?ERK1/2通過促進Runx2 磷酸化誘導(dǎo)成骨分化[30]，ERK1/2 特異的絲氨酸殘基(Ser301、 319)與 Runx2 的激活能力有關(guān)[31]。p38被 BMP 激活后通過促進SMAD1磷酸化及核定位促進成骨分化[32]。PTH具有通過蛋白激酶A(PKA)激活 p38 調(diào)控成骨細胞的功能，說明 PTH是 p38 上游分子之一[38]。

6、FGF 信號通路

? ?成纖維細胞生長因子(FGFs)家族由 22 個分泌性多肽組成，能與 4 個高度同源的酪氨酸激酶受體(FGFR1-4)結(jié)合，引起 FGFR 二聚化并磷酸化自身的酪氨酸殘基，以激活多個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及下游基因，具有調(diào)控多種生長相關(guān)進程的作用，包括軟骨內(nèi)成骨和膜內(nèi)成骨[34]。

? ? FGF-2 可誘導(dǎo)人 MSCs 中 ALP 的表達，但并不改變骨鈣素 mRNA 的表達水平，表明 FGF-2 可能參與了成骨細胞分化早期的調(diào)節(jié)[35]。此外，F(xiàn)GF-2 可誘導(dǎo) Runx2 發(fā)生磷酸化并活化，從而調(diào)節(jié)成骨細胞分化[36]。FGF 信號通路也可通過激活BMP-2和Runx2的表達來調(diào)控成骨分化及骨形成 [37，38]。

三、總結(jié)

? ? 成骨分化是一個涉及多步驟的復(fù)雜生理過程，目前已證實多條信號通路在這一過程中起重要的調(diào)控作用，其中多個信號路通直接或間接影響 Runx2、Osterix /Sp7等成骨關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的表達，最終調(diào)控成骨分化。成骨分化相關(guān)的多條通路相互聯(lián)系相互作用，構(gòu)成了一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，協(xié)同參與骨細胞分化及骨形成的調(diào)節(jié)。

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