前言

帕金森病(PD)是最普遍的神經退行性疾病之一，影響2%-3%的65歲及以上人群。一般來說，PD的特征是中腦黑質中多巴胺能神經元的選擇性缺失。研究人員已經報道了PD的多種分子機制，如線粒體功能障礙、氧化應激、軸突運輸、Ca2+穩態和神經炎癥。特別是，α-synuclein (α-Syn) （路易體的胞內成分）被認為是PD最重要的神經病理學特征之一。在PD患者的多巴胺能神經元、MPTP（四氫吡啶）處理的動物和MPP+（MPTP代謝物）處理的神經母細胞瘤細胞中觀察到α-Syn的積累。此外，有研究報道，α-Syn突變(A30P、A53T和E46K)是罕見家族性PD的主要原因。

因此，清除α-Syn為帕金森病的治療提供了一種合理的途徑。自噬被認為在降解細胞內α-Syn聚集物中起著重要作用。Rapamycin（雷帕霉素）已被證明通過誘導自噬減少α-Syn聚集，從而在體內和體外保護多巴胺能神經元抵抗死亡。不幸的是，Rapamycin缺乏特異性，常常導致口腔和呼吸道感染、白細胞減少、口腔炎、高膽固醇血癥、高甘油三酯血癥、免疫抑制等多種副作用，從而限制了Rapamycin在PD治療中的應用。因此，目前迫切需要尋找其他能夠清除α-Syn聚集物但副作用更少的PD候選治療方法。

GM1神經節苷脂(18:1/18:0)是一種主要的腦神經節苷脂，由三個結構單元組成：一個低聚糖，一個神經酰胺錨點和幾個唾液酸殘基。由于其對神經元可塑性、神經營養物質的釋放、神經傳遞以及與神經調節蛋白的相互作用的調節作用，這種分子被認為是各種大腦功能中必不可少的調節劑。外源性神經節苷脂已經被證明可以影響中樞神經系統中的多巴胺能、谷氨酸能和膽堿能神經元的存活。GM1神經節苷脂的治療作用已在PD患者，以及MPTP治療的小鼠和靈長類動物，顯示神經保護或神經修復作用。盡管有這些積極的數據，但GM1神經節苷脂治療PD的確切機制仍不確定。在以前的報道中，這種治療方法被猜測以自噬依賴的方式降解α-Syn，這促使作者研究自噬是否參與GM1神經節苷脂的抗PD機制。

研究結果

1. GM1神經節苷脂改善了C57BL/6 J小鼠MPTP誘導的行為缺陷，并恢復了多巴胺及其代謝產物的水平

MPTP被酶MAO-B轉化為毒性代謝物MPP+，通過抑制線粒體電子傳遞鏈復合物I殺死多巴胺能神經元。因此，MPTP和MPP+通常分別在體內和體外誘導一種與PD相似的神經元細胞毒性綜合征。在本研究中，C57BL/6 J小鼠腹腔注射MPTP (30 mg/kg) 5天建立PD模型，以評估GM1神經節苷脂的保護作用。治療2周后，進行行為測試，包括爬桿測試、旋轉測試和步態分析。如（圖1a）所示，MPTP處理的小鼠比對照組小鼠花更多的時間爬桿。相比之下，GM1神經節苷脂（靜脈注射，25和50 mg/k）和selegiline（司來吉林MAO-B抑制劑，靜脈注射，60 mg/kg）顯著減少MPTP治療的小鼠爬桿時間。在旋轉測試中，MPTP處理顯著降低了下降潛伏期，為MPTP所致的運動功能障礙。GM1神經節苷脂和selegiline可抑制MPTP誘導的下降潛伏期的下降（圖1b）。

作者進一步評估了GM1神經節苷脂對步態的治療作用，通過包括步速、擺動速度、步頻、跑步持續時間和步行速度等參數的貓步試驗。如（圖1c-g）所示，MPTP處理小鼠的擺動速度和步頻顯著下降，而在步數周期、跑步持續時間和步行速度上，則觀察到顯著增加。相比而言，GM1神經節苷和selegiline的治療有效改善了MPTP引起的這些步態行為障礙(圖1c-g)。此外，GM1神經節苷治療恢復了步態表現(圖1k)。在MPTP處理的小鼠中，增加了四肢的觸摸和懸掛次數(圖1l)，和步法模式的數量(圖1m)。這些行為測試提示GM1神經節苷脂對PD有明顯的治療作用。值得注意的是，GM1神經節苷脂在三個行為測試中的保護作用被3-MA（自噬抑制劑）逆轉（圖1 a-g和k-m）。這一發現表明，GM1神經節苷脂的保護作用可能與自噬有關。

此外，采用高效液相色譜-電化學檢測小鼠紋狀體中多巴胺及其代謝產物的水平。如（圖1h-j）所示，MPTP處理顯著降低了多巴胺、二羥基苯乙酸(DOPAC)和高香草酸(HVA)的水平。GM1神經節苷脂和selegiline治療可防止MPTP誘導的多巴胺、DOPAC和HVA水平減少，提示GM1神經節苷脂能有效改善多巴胺能神經元的功能。

2. GM1神經節苷脂改善MPP+誘導的神經毒性，減少神經元細胞中α-Syn的積累

MPTP的代謝物MPP+在體外可導致神經毒性。因此，作者進一步利用MPP+驗證GM1神經節苷脂對SH-SY5Y細胞的神經保護作用。如（圖2a）所示，GM1神經節苷脂濃度小于320μM時不引起任何細胞毒性。MPP+ （1 mM）顯著抑制細胞增殖，而不同濃度的GM1神經節苷脂（20、40和80 μM）處理可顯著減弱MPP+誘導的細胞增殖抑制（圖2b）。此外，MPP+導致細胞形態發生明顯變化，偽足減少，胞體拉長，GM1神經節苷脂使其恢復（圖2c）。Western blot分析顯示，GM1神經節苷脂處理顯著抑制MPP+誘導的SH-SY5Y細胞鐘α-Syn積累（圖2d）。同樣，GM1神經節苷脂以時間依賴性的方式降低了PC12α-Syn A53T細胞中的α-Syn過表達作用（圖2e）。

線粒體功能缺陷和氧化應激已在PD的發病機制中得到證實。如（圖2g和h）所示，1 mM MPP+處理SH-SY5Y細胞36 h后，線粒體膜電位(δ ψ m)明顯降低，ROS水平升高，而GM1神經節苷脂治療明顯抑制了這些變化。此外，自噬抑制劑（3-MA或bafilomycin A1）可消除GM1神經節苷脂的治療效果。這些體外研究結果與MPTP處理的小鼠的觀察結果一致，進一步提示自噬激活參與了GM1神經節苷脂對PD的保護作用。

3. GM1神經節苷脂誘導神經元細胞自噬

已有研究報道GM1神經節苷脂可誘導促進多種細胞系自噬。體外實驗顯示，不同劑量的GM1神經節苷脂處理SH-SY5Y細胞后，自噬標記物LC3-II增加和自噬底物SQSTM1/p62的降解均增強，特別是在40 μM（圖3a）。另外，在該劑量下，GM1神經節苷脂對細胞處理24 h后，這些自噬相關蛋白的影響最為明顯（圖3b）。為更直觀的觀察GM1神經節苷脂對細胞自噬的促進作用，作者使用mRFP-GFP-LC3標記進行自噬通量測定。Rapamycin（雷帕霉素）通過抑制mTOR[45]發揮自噬誘導作用，作為陽性對照。由于GFP對低pH條件敏感，當自噬小體與溶酶體融合時，GFP(綠色)熒光被熄滅，只能觀察到mRF（紅色）熒光。當GFP和mRFP（黃色）熒光同時出現時，說明自噬小體不與溶酶體結合。與對照組相比，GM1神經節苷脂和Rapamycin處理的細胞中紅色斑點明顯增多，而GM1神經節苷脂和bafilomycin A1聯合處理可增強黃色斑點（圖3c），說明GM1神經節苷脂增強了SHSY5Y細胞的自噬通量。

4. GM1神經節苷脂激活自噬有助于清除α-Syn

由于去除異常的α-Syn為PD的治療提供了一個很有潛力的策略，早期研究表明自噬介導的α-Syn降解有利于對PD的保護作用。GM1神經節苷脂對MPTP誘導的小鼠及MPP+誘導的細胞的保護作用被3-MA和bafilomycin A1阻斷，說明可能與自噬激活有關。如預期的那樣，3-MA顯著消除了GM1神經節苷脂對MPP+處理SH-SY5Y細胞中α-Syn蛋白水平的影響（圖4a）。作者隨后進一步確定GM1神經節苷脂對自噬過程的影響。數據顯示，MPP+存在下，GM1神經節苷脂處理明顯促進了SH-SY5Y細胞中LC3-I向LC3-II的轉化，同時自噬底物SQSTM1/p62蛋白水平下降（圖4b）。此外，透射電鏡顯示，GM1神經節苷脂處理小鼠的黑質中存在明顯的自噬泡（圖4c）。重要的是，共聚焦顯微鏡圖像顯示GM1神經節苷脂誘導的自噬小體與MPP+誘導的α-Syn共定位（圖4d）。這些體內和體外數據表明，GM1神經節苷脂激活自噬，參與α-Syn清除。

此外，作者使用doxycycline誘導α-Syn A53T表達的PC12α-Syn A53T細胞，驗證GM1神經節苷脂對自噬和α-Syn清除的影響。共聚焦顯微鏡結果（圖5a）顯示，在PC12α-Syn A53T細胞中，GM1神經節苷脂處理后LC3斑點增加，而doxycycline誘導的α-Syn積累減少，其中LC3和α-Syn的共定位顯著增強（圖5a）。Western blot分析證實，GM1神經節苷脂導致α-Syn蛋白水平下降，而3-MA共處理逆轉了這一趨勢（圖5b）。與GM1神經節苷脂類似，Rapamycin也能強烈降低α-Syn水平（圖5b）。作者采用化學反應方法，用熒光FITC熒光標記GM1神經節苷脂。在受GM1-FITC處理的PC12α-Syn A53T細胞中觀察到強烈的綠色熒光（圖5c）。同時，在PC12α-Syn A53T細胞中，GM1-FITC和α-Syn以及GM1-FITC和LC3之間觀察到明顯的共定位（圖5d）。綜上所述，這些數據表明GM1神經節苷脂激活自噬來清除α-Syn的積累。

5. ATG13-ULK1復合物參與GM1神經節苷脂誘導的自噬

ULK復合體由ULK1、ATG13、FIP200和ATG101組成，它們是啟動自噬過程所必需的。作者評估了GM1神經節苷脂對ULK1和ATG13蛋白表達水平的影響。值得注意的是，GM1神經節苷脂處理促進了PC12α-Syn A53T細胞中ATG13和ULK1的磷酸化（圖6a）。然而，GM1神經節苷脂的作用被3-MA抑制（圖6a）。同樣，GM1神經節苷脂處理的SH-SY5Y細胞也顯示出p-ATG13/ATG13的比例增加，而3-MA處理抑制了GM1神經節苷脂的這種作用（圖6b）。綜上所述，GM1神經節苷脂通過激活ATG13-ULK1復合物來誘導自噬。

總結

總的來說，作者通過MPTP/MPP+處理建立了α-Syn過表達模型，以評估GM1在體內和體外對PD的治療作用。此外，使用表達誘導型α-Syn的PC12α-Syn A53T細胞來證明GM1和α-Syn之間的直接關系。研究結果表明，自噬的激活解釋了GM1神經節苷脂的抗PD作用，并為GM1神經節苷脂清除α-Syn的機制提供了可能的理論基礎。