一、概述

? ? ? ?成骨分化是骨生成的關鍵步驟，即骨髓間充質干細胞經歷骨原細胞、成骨細胞最終分化為骨細胞的一個復雜的過程，其中涉及到多種類型細胞間和細胞內的信號傳遞，如信號通路、轉錄因子、生長因子、 MicroRNA 等，形成了一個完整的骨代謝調控負反饋環路[1]。成骨分化最基本的生物學特征是骨基質合成、分泌、礦化及成熟。

? ? ? 骨基質是鈣化的細胞間質，包括有機質和無機質兩種成分。有機質的主要成分是骨膠原纖維即骨膠原(bone collagen)，由成骨細胞合成，主要由Ⅰ型膠原蛋白組成，另有一類是被稱為無定形基質(ground substance)的非膠原蛋白，如骨鈣素（OCN）、堿性磷酸酶（ALP）、骨橋蛋白（OPN）、骨結合素（ON）、骨唾液酸蛋白（BSP）、骨生長調節因子等。骨基質中的無機質為無機鹽，按含量多少依次是磷酸鈣、碳酸鈣、檸檬酸鈣，它們主要以羥基磷灰石的結晶形式分布于骨的有機質中。無定形的磷酸鈣發展為羥基磷灰石結晶埋于骨的有機質間隙中的過程，通常稱為骨礦化(bone mineralization)。

? ? ? ?Runt相關轉錄因子2（Runx2）和Sp1轉錄家族成員Osterix/Sp7被認為是成骨分化調控網絡的關鍵節點[2]。Runx2促進成軟骨細胞和成骨細胞表達的主要胞外基質（包括ALP、OPN、OCN、BSP 、I型膠原和X型膠原）的表達[3，4]，而且能夠激活Osterix/Sp7表達[5]。Osterix/Sp7也驅動成骨細胞表達外基質，包括I型膠原、ALP、OC、OPN、BSP和OCN[6，7]。

二、成骨分化相關信號通路

1、BMP-Smads 信號通路

? ? ? ??BMPs 在骨代謝過程中起著關鍵性的調控作用。BMPs 屬于轉化生長因子 β (TGF-β)超家族，是一類多效性細胞因子，根據序列相似性和功能可以將 BMPs 分為4個亞族：BMP-2和BMP-4，BMP-5、-6、-7、-8a 和-8b，BMP-9和BMP-10，BMP-3、-3b、-11、-12、-13、-14、-15 和-16。其中，BMP-2、-7、-6、-9 能夠促進骨質形成[8]，而 BMP-3 對成骨具有負調控作用[9]。TGF-β 超家族的成員均通過結合雙受體系統——I型和II型跨膜絲氨酸/蘇氨酸激酶受體(BMPR-I、BMPR-II)介導信號轉導。而在膜信號傳入核內的過程中，Smad 信號通路發揮著主要作用。

? ? ? ?BMP 信號分子結合并激活 BMPR-II，使BMPR-I 磷酸化并進一步磷酸化BMP 活化型 Smads（BR-Smads，為Smad1、5、8）的 C 末端 DNA 結合域，磷酸化的BR-Smads 與共同通路型Smads（Co-Smads，為Smad4）結合形成異質低聚體進入核內與轉錄因子相互作用（如圖1所示），共同激活成骨細胞特異性轉錄因子（Runx2、 Sp7等）表達，從而誘導 MSCs 向成骨細胞分化及骨形成 [10-12]。在骨髓間充質干細胞(BMSCs)中 BR-Smads 又可以與 Runx2 以物理結合的方式進一步誘導成骨分化[13]。BMP-Smads 信號通路上調Msx2表達，而Msx2促進Osterix/Sp7表達，這一過程不依賴Runx2[14]。I-Smads可以抑制 BR-Smads 和Co-Smads 的作用。此外，Samds 的活性還受到許多因素的調控。小C端結構域磷酸酶1、2 (SCP-1、 SCP-2)介導 Smads 的去磷酸化可抑制后者的轉錄活性[15]。E3泛素連接酶1（Smurf1）使 Smad1、 5泛素化而被 26S 蛋白酶體識別和降解[16]，Smurf2僅介導Smad1泛素化 [17]。

? ? ? ?此外BPM2信號促進E1A結合蛋白p300介導的Runx2乙酰化，而乙酰化增強Runx2的轉錄激活活性，并且抑制Smurf1介導的Runx2泛素化降解。HDAC4和HDAC5使Runx2去乙酰化，允許Runx2被Smurf1泛素化而降解[18]。

圖1??BMP-Smads 信號

2、Wnt/β-Catenin 信號通路

? ? ? ?Wnts是一類與卷曲蛋白受體（FZD）結合的分泌型糖蛋白。Wnt家族參與細胞極化、分化、遷移、增殖和生物學功能等多個細胞生理過程。Wnt 蛋白可以大致分為兩類：一類激活經典的 Wnt信號通路，即 Wnt/β-Catenin 信號通路；另一類由Wnt5a 激活非經典的Wnt通路，配體與FZD結合后不依賴于β-Catenin 和 LRP5/6。

? ? ? ?Wnt/β-Catenin經典信號通路中，Wnt 配體與 FZD 或低密度脂蛋白受體相關蛋白 5/6 (LRP5/6)形成復合物。當胞外缺乏Wnt蛋白時，該復合體無法形成，此時軸蛋白2（Axin2）、糖原合酶激酶 3β（GSK-3β）、大腸腺瘤樣蛋白（APC）、肌酸激酶1（CKMT1） 等組成復合體，該復合體可降解β-Catenin，胞漿及核內的 β-Catenin水平降低，最終抑制Wnt/β-Catenin 信號通路；當 Wnt 分子與LRP5/6-FZD 受體復合體結合， LRP5/6 胞內端磷酸化而產生軸蛋白 Axin2 的結合位點，Axin2 結合到該位點能抑制 GSK-3β介導的β-Catenin 水解，引起 β-Catenin 增加并進入核內，與細胞核中的 T 細胞因子(TCF)/淋巴增強因子(LEF)轉錄復合物結合（如圖2所示），作為轉錄激活因子可引起下游靶基因表達，從而發揮調控作用[19]。

? ? ? ?經典Wnt信號通路在調節成骨細胞分化及骨形成方面是通過作用于Runx2起作用。Runx2 基因啟動子序列包含一個 TCF作用元件，它能將β-catenin 及 TCF1 募集到該位點，繼而啟動 Runx2及下游靶基因的表達，從而調節成骨細胞分化及骨形成[20]。此外LRP5 能通過上調 Runx2及ALP的表達促進 MSCs 向成骨細胞分化，同時下調 CCAAT 增強子結合蛋白 α 及過氧化物酶體增殖物激活受體 γ 的表達來抑制脂肪形成[21]。

Wnt/β-Catenin 信號通路

3、Notch 信號通路

? ? ? ?Notch 信號通路在進化上高度保守，其在細胞發育、增殖、凋亡和分化均具有調控作用。Notch 本身是一類在進化上高度保守的受體蛋白，在哺乳動物中 Notch 受體的同源分子有 4 種，分別為 Notch1、 2、 3、 4。配體同源分子目前已知有12種，根據結構不同將 12 種配體分為四類。Notch 的受體和配體為跨膜蛋白，其發揮功能依賴于相鄰細胞間的相互接觸。

? ? ? ?當相鄰細胞表面的同源配體與受體結合，Notch受體的胞外部分和跨膜部分分別經 TACE、 γ-分泌酶水解，引起 Notch 受體胞內部分(NICD)從細胞膜上脫落并移入核內。在細胞核中 NICD 與 RBPJ、 MAML相互作用，將轉錄抑制子轉化為激活子，激活下游 HES 家族、 HEY 家族等的基因表達[22]。

? ? ? ?NICD 過表達的 MC3T3-E1 細胞在成骨分化過程中鈣結節的形成量顯著增加，外源性 Notch 可以誘導多能間充質細胞系(C3H10T1/2)成骨分化，抑制成脂分化[23]。Notch下游基因 Hes-1能與 Runx2 相互作用并增強后者作為轉錄激活子的活性，Notch 信號通路的激活子Maml 也能夠激活骨組織 Runx2 的轉錄[24]。Notch信號通路也通過轉錄激活Osterix /Sp7，以及上調細胞周期蛋白D 和周期蛋白 E 來實現的提高成骨細胞增殖能力[25]。

4、Hedgehog 信號通路

? ? ? ?Hedgehog 信號通路同樣在進化上高度保守，在發育和內穩態方面起著重要作用。Hedgehog是一類分泌型信號蛋白，在哺乳動物體內可分為三類：Sonic Hedgehog (SHH), Indian Hedgehog (IHH), Desert Hedgehog (DHH)。當胞外 Hedgehog 蛋白與跨膜受體(Ptch1)結合即解除對SMO抑制并進一步使之磷酸化，活化的 SMO與 Cos2、 Fu 結合形成復合物，該復合物可激活鋅指蛋白家族 Ci/G li，促使它們進入核內聚集并激活轉錄，從而啟動下游靶基因表達[26]。

? ? ? ?SHH 能上調成骨細胞系Osterix /Sp7的表達，促進成骨細胞產生并間接上調破骨細胞的活力[27]。IHH通過Gli2上調 Runx2 的表達來調控成骨細胞分化[28]。Ptch1缺陷的成骨前體細胞由于與Runx2 的反應性增加及 GLI3 抑制物產生減少而表現為成骨分化速度增快[29]。

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5、MAPK 信號通路

? ? ? ?傳統的絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)包括三個亞家族成員：ERK1/2、 ERK5， JNK1/2/3， p38。MAPK 通路主要參與轉導胞外刺激(環境壓力、生長因子、細胞因子等)引起細胞生長、分化和凋亡。一旦細胞接觸刺激物， MAPKK 激酶(MAP3K)被激活并磷酸化 MAPK 激酶(MAP2K)，而后磷酸化激活MAPKs [30]。

? ? ? ?ERK1/2通過促進Runx2 磷酸化誘導成骨分化[30]，ERK1/2 特異的絲氨酸殘基(Ser301、 319)與 Runx2 的激活能力有關[31]。p38被 BMP 激活后通過促進SMAD1磷酸化及核定位促進成骨分化[32]。PTH具有通過蛋白激酶A(PKA)激活 p38 調控成骨細胞的功能，說明 PTH是 p38 上游分子之一[38]。

6、FGF 信號通路

? ? ? ?成纖維細胞生長因子(FGFs)家族由 22 個分泌性多肽組成，能與 4 個高度同源的酪氨酸激酶受體(FGFR1-4)結合，引起 FGFR 二聚化并磷酸化自身的酪氨酸殘基，以激活多個信號轉導途徑及下游基因，具有調控多種生長相關進程的作用，包括軟骨內成骨和膜內成骨[34]。

? ? ? ?FGF-2 可誘導人 MSCs 中 ALP 的表達，但并不改變骨鈣素 mRNA 的表達水平，表明 FGF-2 可能參與了成骨細胞分化早期的調節[35]。此外，FGF-2 可誘導 Runx2 發生磷酸化并活化，從而調節成骨細胞分化[36]。FGF 信號通路也可通過激活BMP-2和Runx2的表達來調控成骨分化及骨形成 [37，38]。

三、總結

? ? ? 成骨分化是一個涉及多步驟的復雜生理過程，目前已證實多條信號通路在這一過程中起重要的調控作用，其中多個信號路通直接或間接影響 Runx2、Osterix /Sp7等成骨關鍵轉錄因子的表達，最終調控成骨分化。成骨分化相關的多條通路相互聯系相互作用，構成了一個復雜的網絡，協同參與骨細胞分化及骨形成的調節。

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