IF：8.4

研究思路：靶點(diǎn)結(jié)構(gòu)分析，數(shù)據(jù)庫虛擬篩選，激酶活性實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、化合物結(jié)構(gòu)優(yōu)化、體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，分子水平作用機(jī)制，藥物作用模式分析，作用機(jī)制實(shí)驗(yàn)。

一、背景

? ? ? ?再生肝磷酸酶(PRL)癌蛋白是在多種腫瘤組織中過度表達(dá)的磷酸酶。PRL水平升高與腫瘤的轉(zhuǎn)移和不良的臨床結(jié)果有關(guān)。理論上，PRL磷酸酶可以提供有效的治療靶點(diǎn)，但由于缺乏特異性靶向它的化合物，PRL磷酸酶在腫瘤治療上仍然沒有得到足夠的利用。

二、目的

? ? ? ? PRL磷酸酶是通過三聚體來發(fā)揮利用，利用這種獨(dú)特的性質(zhì)，借助虛擬篩選和藥物化學(xué)的方法，尋找能夠破壞這種三聚體結(jié)構(gòu)的化合物，從而抑制PRL磷酸酶的活性。通過體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證化合物的抗腫瘤效果。

三、方法

? ? ? 虛擬篩選：從ZINC database中，篩選能與PRL1單體間界面結(jié)合的化合物。分兩步對接，剛性對接（DOCK6.2），柔性對接（圖1A、B）。

圖1 PRL1三聚體結(jié)構(gòu)（A）及虛擬篩選流程（B）

激酶活性實(shí)驗(yàn)：體內(nèi)、體外。

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：劃痕實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。

化合物結(jié)構(gòu)優(yōu)化：細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證：構(gòu)建表達(dá)?PRL磷酸酶的細(xì)胞和表達(dá)三聚體缺陷PRL磷酸酶的細(xì)胞。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證：小鼠實(shí)驗(yàn)，表達(dá)PRL磷酸酶的小鼠和PRL磷酸酶缺失小鼠的胚胎成纖維細(xì)胞。

分子水平作用機(jī)制：PRL 1通過激活ERK 1/2和AKT途徑促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移，探究化合物對ERK 1/2和AKT途徑的影響。

藥物作用模式分析：驗(yàn)證化合物作用于PRL的三聚體界面。

作用機(jī)制實(shí)驗(yàn)：黑色素瘤TCGA表達(dá)數(shù)據(jù)驗(yàn)證PRL 1的促癌作用，體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證化合物的抑癌機(jī)制。

四、研究成果

經(jīng)兩步虛擬篩選后，得到56 hits，體外和體內(nèi)激酶實(shí)驗(yàn)，篩選到3個(gè)化合物（圖2C）能夠顯著降低細(xì)胞內(nèi)PRL1三聚體的形成，其中Cmpd-43最顯著（圖2D）。Cmpd-43對細(xì)胞的侵襲和遷移也有一定的抑制作用（E、F）

?

圖2?3 hits（C）、體內(nèi)激酶試驗(yàn)（D）細(xì)胞實(shí)驗(yàn)（E、F）?

? 對Cmpd-43結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化，得到7個(gè)類似物（圖3A），細(xì)胞的遷移實(shí)驗(yàn)表明，類似物 -3顯示出與CMPD-43相似的效果，而類似物2和4-7似乎比CMPD-43略小。但是類似物-1對細(xì)胞增殖或遷移沒有影響，這表明在類似物-1中缺失的亞氨基甲基芳族部分對PRL1三聚體抑制活性是關(guān)鍵的（圖3B）。

圖3?Cmpd-43及其類似物對細(xì)胞增殖或遷移的影響

?表達(dá) PRL磷酸酶的細(xì)胞促進(jìn)了細(xì)胞的增殖和遷移，而表達(dá)三聚體缺陷PRL磷酸酶的細(xì)胞增殖和遷移能力和對照細(xì)胞相似，說明PRL磷酸酶的三聚體結(jié)構(gòu)在促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移中扮演重要的角色（圖4?A、B）。用Cmpd-43和類似物-1處理表達(dá) PRL磷酸酶的細(xì)胞和表達(dá)三聚體缺陷PRL磷酸酶的細(xì)胞。Cmpd-43能抑制表達(dá) PRL磷酸酶的細(xì)胞，其余的處理組均沒有抑制效果（圖4?C）。小鼠實(shí)驗(yàn)也證明，Cmpd-43能抑制表達(dá) PRL磷酸酶的細(xì)胞，而對PRL磷酸酶缺失的細(xì)胞無影響（圖4?D）。WB實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，CMP D-43(5 mmol/l)能特異性抑制Prl 1介導(dǎo)的HEK 293細(xì)胞ERK 1/2和AKT通路的活化。

圖4?Cmpd-43及類似物-1對表達(dá)PRL磷酸酶/PRL磷酸酶缺陷細(xì)胞的影響

?為了驗(yàn)證Cmpd-43是作用于PCL的三聚體界面，從而發(fā)揮抑制作用，我們將類似物-3和Cmpd-43分別與PRL磷酸酶共結(jié)晶，得到了類似物-3結(jié)合的PRL1的共晶體，通過結(jié)合模式的分析，發(fā)現(xiàn)類似物-3確實(shí)是與PCL的BC界面結(jié)合，并且與周圍的氨基酸殘基作用形成了穩(wěn)定的構(gòu)象（圖5 ABC）。類似物-3與?Tyr14 and Phe132具有較強(qiáng)疏水性接觸，而對二聚體界面結(jié)合表面的分析表明，這兩種殘基對三聚體形成的貢獻(xiàn)十分有限，因此推測，這兩個(gè)殘基突變會影響類似物-3與PCL的結(jié)合，但是不會影響PCL的三聚體結(jié)構(gòu)。我們對Tyr14 and Phe132進(jìn)行了Ala替換。?結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用Ala取代bar 14和ph 132對PCL三聚和PCL介導(dǎo)的細(xì)胞遷移沒有影響（圖5 DE），并且突變體對Cmpd-43呈現(xiàn)出抗性。這些結(jié)果表明類似物-3和Cmpd-43是結(jié)合在PRL三聚體界面并防止PRL三聚反應(yīng)。

圖5 類似物-3和Cmpd-43結(jié)合到PRL磷酸酶三聚體界面并阻止PRL三聚結(jié)構(gòu)形成

黑色素瘤TCGA表達(dá)數(shù)據(jù)驗(yàn)證PRL 1的促癌作用（圖6 ABC）Cmpd-43能抑制人黑色素瘤細(xì)胞的增殖和遷移（圖6 DE）。Cmpd-43也能降低HGF誘導(dǎo)的Erk1/2和Akt磷酸化（圖6FG）。除了PRL 1，PRL 2和PRL 3也能形成三聚體結(jié)構(gòu)，通過敲除起主要作用的PRL 1和PRL 2，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的ERK1/2 and Akt通路受到抑制（HI），說明Cmpd-43能夠同時(shí)抑制PRL 1，PRL 2和PRL 3的活性。

圖6 Cmpd-43對黑色素瘤細(xì)胞系MeWo.具有抑制作用

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黑色素瘤小鼠模型實(shí)驗(yàn)，再次驗(yàn)證Cmpd-43通過抑制ERK1/2 and Akt通路，起到抑癌作用（圖7）。

圖7?Cmpd-43在體內(nèi)抑制黑色素瘤移植瘤的生長