本期主要為大家推薦的一篇是關(guān)于circRNA海綿吸附作用于miRNA調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白依靠性激酶的表達(dá)，再通過探討細(xì)胞周期蛋白依靠性激酶相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子來在前列腺癌中的作用。

前列腺癌是最常見的惡性腫瘤之一，也是導(dǎo)致男性癌癥相關(guān)死亡的第二大原因。目前器官前列腺癌的主要治療方法是通過前列腺切除術(shù)或放射治療，但是轉(zhuǎn)移性前列腺癌的治療方法主要還是通過雄激素剝奪療法。一旦出現(xiàn)激素耐受后，前列腺癌迅速發(fā)展，晚期前列腺癌通常在18個月內(nèi)致命。所以需要進(jìn)一步了解前列腺癌變和耐藥的分子機(jī)制。

細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）是絲氨酸/蘇氨酸激酶，CDKs分子至少有13種，通過改變其活性來介導(dǎo)腫瘤相關(guān)的細(xì)胞周期絮亂，其中CDK12和CDK13研究頗多。在前列腺癌樣本中，CDK12表達(dá)異常，表明CDK12缺失導(dǎo)致基因座的高度重復(fù)性增益從而參與細(xì)胞周期和DNA復(fù)制，而CDK13在前列腺癌中的研究較少。

研究表明CircRNA在多種疾病中表達(dá)下調(diào)，通過海綿吸附作用miRNA在腫瘤的增殖、凋亡以及耐藥等生物學(xué)過程中發(fā)揮獨特的功能。因此本文作者通過設(shè)計內(nèi)源性基因CDK13在轉(zhuǎn)錄水平上計劃來調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子E2F5的表達(dá)，從而促進(jìn)CircCDK13的形成，海綿吸附作用于miR-212-5p/449a從而正反饋調(diào)控E2F5的表達(dá)來探討前列腺癌的發(fā)展。

原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33390186/，影響因子：7.038

01??CDK13在前列腺癌組織樣本中高表達(dá)

作者選取30對前列腺癌組織和良性前列腺增生組織進(jìn)行QPCR和WB驗證，結(jié)果表明前列腺癌組織中的CDK12表達(dá)水平顯著高于良性前列腺增生組織；從TCGA數(shù)據(jù)庫中選取94例列腺癌組織數(shù)據(jù)和42例良性前列腺增生組織數(shù)據(jù)分析，所得結(jié)果跟QPCR和WB結(jié)果相一致。

02??過表達(dá)CDK13促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的增殖以及抑制細(xì)胞凋亡

用QPCR和WB的方法驗證CDK13在四株不同前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況，相對于正常前列腺上皮細(xì)胞，CDK12在PC3和 22RV1細(xì)胞中表達(dá)顯著升高；同時也進(jìn)行HE和免疫組化實驗，結(jié)果和QPCR、WB一樣；在PC3和22RV1細(xì)胞中構(gòu)建敲低和過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，通過CCK8，平板克隆形成實驗檢測增殖、以及流式檢測凋亡，這些結(jié)果表明CDK13能促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的增殖以及抑制細(xì)胞凋亡。

03??CDK13促進(jìn)E2F5在前列腺癌細(xì)胞中高表達(dá)

通過CoIP-MS實驗，用CDK13調(diào)取相互作用蛋白，結(jié)果表明，共調(diào)取出10種蛋白，其中轉(zhuǎn)錄因子E2F5最有可能跟CDK13相互作用。用2對前列腺癌和正常前列腺上皮組織芯片觀察E2F5的表達(dá)水平，結(jié)果表明E2F5在前列腺癌組織芯片中高表達(dá)；通過免疫共沉淀和免疫熒光，結(jié)果表明CDK13和E2F5在PC3細(xì)胞和前列腺癌組織中存在強烈的相互作用；作者也收集了30對癌組織和正常組織進(jìn)行QPCR鑒定，以及在TCGA數(shù)據(jù)庫中和應(yīng)用免疫組化觀察E2F5在組織中的表達(dá)情況，這些結(jié)果表明E2F5在前列腺組織中高表達(dá)。

作者通過CRISPR-Cas9技術(shù)激活內(nèi)源性CDK13轉(zhuǎn)錄和在PC12細(xì)胞中瞬轉(zhuǎn)敲低以及過表達(dá)E2F5質(zhì)粒觀察CDK13、E2F5和p12基因表達(dá)水平，結(jié)果表明，相對于過表達(dá)E2F5質(zhì)粒，敲低E2F5引起E2F5和CDK13的表達(dá)水平顯著降低。作者接下來通過MTS實驗、平板克隆形成實驗以及蛋白pull down實驗表明CDK13和E2F5相互作用并促進(jìn)PC12和22RV1細(xì)胞的增殖。

04??激活內(nèi)源性CDK13轉(zhuǎn)錄引起CircCDK13的形成引起E2F5表達(dá)上調(diào)

作者發(fā)現(xiàn)在激活內(nèi)源性CDK13轉(zhuǎn)錄細(xì)胞中的CDK13和E2F5蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)；在敲低CDK13細(xì)胞中觀察E2F5蛋白水平顯著降低，但是E2F5 mRNA表達(dá)水平無明顯變化。在激活內(nèi)源性CDK13轉(zhuǎn)錄細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)CircCDK13高表達(dá)。接著作者通過觀察過表達(dá)CircCDK13在PC12和22RV1的增殖情況，結(jié)果表明過表達(dá)CircCDK13能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖能力。

05??CircCDK13海綿吸附作用miR-221-5p/449a調(diào)控E2F5蛋白表達(dá)

作者通過網(wǎng)站預(yù)測找出能夠和CircCDK13相互結(jié)合作用的miRNA，通過RNA pull down結(jié)合RT-QPCR的方法確定miR-212-5p和miR-449a最有可能跟CircCDK13相互結(jié)合，然后通過雙熒光素酶以及亞細(xì)胞定位最終確定它們的結(jié)合關(guān)系。最后通過合成miR-212-5p和miR-449a mimic看下游CDK13和E2F2蛋白表達(dá)情況，結(jié)果表明CDK13和E2F2蛋白表達(dá)水平顯著減低。

06??E2F2激活CDK13基因的轉(zhuǎn)錄并正反饋調(diào)控circCDK13的形成

過表達(dá)或者敲低E2F2在PC3細(xì)胞中，QPCR結(jié)果表明過表達(dá)E2F2后，CDK13和circCDK13 mRNA表達(dá)水平顯著升高，反之則降低。通過網(wǎng)站預(yù)測CDK13基因和轉(zhuǎn)錄因子E2F2的結(jié)合位點，進(jìn)行Chip和雙熒光素酶實驗，結(jié)果說明了CDK13和E2F2能夠相互結(jié)合。接下來為了闡明CDK13-circCDK13-miR-212-5p/miR-449a-E2F5之間的調(diào)控關(guān)系對前列腺癌發(fā)展的影響，分別在PC3和22RV1細(xì)胞中共瞬轉(zhuǎn)過表達(dá)circCDK13和過表達(dá)E2F5質(zhì)粒觀察E2F5、CDK13和p21的表達(dá)情況，結(jié)果表明E2F5和CDK13表達(dá)水平顯著升高，而p21表達(dá)水平顯著降低。最后敲低circCDK13和miR-212-5p/miR-449a mimic相互作用觀察E2F5、CDK13和p21在PC3、22RV1細(xì)胞的表達(dá)情況和影響細(xì)胞增殖的情況，結(jié)果表明敲低circCDK13的同時過表達(dá)miR-212-5p/miR-449a，E2F5、CDK1蛋白表達(dá)水平顯著降低，而p21表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞的增殖速度也起到了抑制作用。

07??CDK13-circCDK13-miR-212-5p/miR-449a-E2F5調(diào)節(jié)軸參與體內(nèi)前列腺腫瘤的發(fā)生

為了明確CDK13-circCDK13-miR-212-5p/miR-449a-E2F5在前列腺腫瘤中的作用，作者構(gòu)建了sh-circCDK13、sh-E2F5以及sh-circCDK13+sh-E2F5穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株用于接種動物，結(jié)果表明，sh-circCDK13和sh-E2F5共同作用后明顯抑制了腫瘤的發(fā)展，腫瘤體積顯著減少。同時WB檢測腫瘤組織中相關(guān)蛋白表達(dá)水平和和tunel實驗檢測細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果表明CDK13和E2F5蛋白表達(dá)水平顯著降低，而p12蛋白表達(dá)顯著升高。以上結(jié)果說明了同時抑制circCDK13和E2F5對前列腺腫瘤的發(fā)展起到抑制的作用。