導(dǎo)言

今天小編分享一篇2020年4月3日發(fā)表于Nature Communications的文章——An oncopeptide regulates m6A recognition by the m6A reader IGF2BP1 and tumorigenesis. N6-甲基腺苷（m6A）是真核RNA中最普遍的修飾。m6A的生物學(xué)重要性取決于控制 mRNA 命運(yùn)和功能的m6A閱讀蛋白。然而，m6A閱讀蛋白的其他調(diào)控亞基是否參與RNA的m6A識(shí)別尚待探討。在這里，研究者發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)鏈非編碼RNA（LncRNA）LINC00266-1編碼71個(gè)氨基酸肽。該肽主要與包括m6A閱讀蛋白IGF2BP1 在內(nèi)的RNA 結(jié)合蛋白相互作用，因此被稱為“RNA結(jié)合調(diào)節(jié)肽”（RBRP）。RBRP與IGF2BP1結(jié)合并增強(qiáng)IGF2BP1對(duì)RNA（例如c-Myc mRNA）的m6A識(shí)別，從而增加mRNA的穩(wěn)定性和c-Myc的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤發(fā)生。高表達(dá)RBRP的癌癥患者預(yù)后較差，因此由LINC00266-1編碼的癌肽RBRP 是m6A閱讀蛋白的調(diào)節(jié)亞基，并通過(guò)m6A閱讀蛋白增強(qiáng)對(duì)靶RNA的m6A識(shí)別，從而發(fā)揮致癌作用。

前期研究

目前研究發(fā)現(xiàn)具有編碼功能的LncRNA都必須與核糖體結(jié)合，所以作者對(duì)SW480和SW620細(xì)胞的核糖體結(jié)合的LncRNA進(jìn)行測(cè)序，得到384個(gè)有差異表達(dá)的LncRNA，再通過(guò)軟件分析找出55個(gè)具有編碼潛力的LncRNA。進(jìn)一步篩選了10個(gè)LncRNA，分別與起始密碼子突變的GFP（GFPmut）的N末端融合，將構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到HeLa細(xì)胞中檢測(cè)GFP熒光。結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有LINC00266-1和FLJ20021的ORF能夠被翻譯（圖a）。通過(guò)對(duì)LINC00266-1的分析，研究者發(fā)現(xiàn)一個(gè)213個(gè)核苷酸的短ORF，參與編碼71-aa肽，將其命名為RBRP。通過(guò)序列比較，表明RBRP是一個(gè)未被鑒定過(guò)的肽。在 LINC00266-1 ORF-Flag（ORF）和5'UTR-ORF-Flag（5'U）轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中觀察到RBRP-Flag融合肽的大量表達(dá)，而起始密碼子ATG（5' UTR-ORFmut-Flag，MT）取消了LINC00266-1中預(yù)測(cè)的ORF的翻譯（圖b，c）。進(jìn)一步將LINC00266-1 ORF-GFPmut融合構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中，使用GFP抗體免疫沉淀RBRP-GFP融合肽，質(zhì)譜鑒定RBRP肽中兩個(gè)獨(dú)特的肽片段（圖d）。

接下來(lái)，研究者鑒定具有編碼潛力的LncRNA。用抗RBRP抗體檢測(cè)細(xì)胞RBRP肽驗(yàn)證細(xì)胞和組織中天然內(nèi)源性RBRP肽的存在和表達(dá)。在結(jié)直腸癌、乳腺癌、卵巢癌和鼻咽癌細(xì)胞中驗(yàn)證了天然內(nèi)源性RBRP肽（圖a，b）。此外，RBRP肽被證實(shí)是天然內(nèi)源性的在五對(duì)配對(duì)的新鮮原發(fā)性結(jié)直腸癌組織及其相應(yīng)的鄰近非腫瘤性結(jié)直腸組織中產(chǎn)生（圖c）。最后，利用MS分析鑒定了天然內(nèi)源性RBRP肽中的三個(gè)獨(dú)特肽片段進(jìn)一步表明天然內(nèi)源性RBRP肽存在于癌癥組織中。通過(guò)Kaplan-Meier生存分析顯示，RBRP水平較高的結(jié)直腸癌患者的癌癥相關(guān)死亡風(fēng)險(xiǎn)高于RBRP水平較低的患者，并且高RBRP水平與結(jié)直腸癌患者不良預(yù)后之間存在顯著的相關(guān)性（圖f-g）。前期的研究結(jié)果表明，RBRP可能是一個(gè)潛在的致癌基因。

功能驗(yàn)證

為了研究LINC00266-1有沒有直接致癌作用，研究者通過(guò)shRNA直接把其敲低，通過(guò)腫瘤細(xì)胞增殖、集落形成、遷移和侵襲檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：敲除LINC00266-1后，細(xì)胞生長(zhǎng)、集落形成、遷移和侵襲顯著減少，而添加ORF表達(dá)后這些改變恢復(fù)到對(duì)照水平，但Mut組沒有恢復(fù)。這表明RBRP 肽可以促進(jìn)腫瘤發(fā)生，但LINC00266-1本身并不促進(jìn)（圖a-d）。細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)做完后，研究者在動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證，結(jié)果與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)相符，即恢復(fù)組促進(jìn)癌細(xì)胞增長(zhǎng)，而Mut組沒有變化（圖e-g）。總的來(lái)講，研究者發(fā)現(xiàn)由LncRNA LINC00266-1編碼產(chǎn)生的RBRP肽有致癌作用（不是LINC00266-1本身），并且RBRP在體外和體內(nèi)均能促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。

深入挖掘

研究者進(jìn)一步探究RBRP是如何影響下游靶蛋白而導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。利用Co-IP拉下與其相互結(jié)合的蛋白并進(jìn)行質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)蛋白IGF2BP1。雙向Co-IP證明RBRP和IGF2BP1的相互結(jié)合關(guān)系。首先用RNaseA酶排除RNA中間體的關(guān)系，再用截?cái)嗍紺o-IP發(fā)現(xiàn)RBRP結(jié)合于IGF2BP1 KH3-4雙結(jié)構(gòu)域（圖a-f）。先前的研究報(bào)道，KH3-4雙結(jié)構(gòu)域中的GxxG基序?qū)τ趍6A的識(shí)別和結(jié)合是必不可少的。所以研究者在KH3-4雙結(jié)構(gòu)域中將GxxG突變?yōu)镚EEG，可完全消除RBRP與IGF2BP1的相互作用。接下來(lái)研究了RBRP與IGF2BP1結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，結(jié)果發(fā)現(xiàn)G19而非A的G19 突變破壞了RBRP與IGF2BP1的結(jié)合（圖i，j），這表明RBRP中的G19殘基對(duì)于IGF2BP1結(jié)合是必不可少的。綜合分析，RBRP 可綁定到RNA m6A閱讀蛋白IGF2BP1上。

那到底是RBRP還是LINC00266-1增加了IGF2BP1對(duì)m6A的修飾？之前有研究表明IGF2BP1通過(guò)與編碼區(qū)不穩(wěn)定決定因子（CRD）結(jié)合穩(wěn)定c-Myc mRNA，所以研究者以c-Myc CRD為檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)RNA pulldown、RIP-QPCR、Dot blot實(shí)驗(yàn)對(duì)比LINC00266-1 NC/ORF/MT組，驗(yàn)證了RBRP增加了IGF2BP1與m6A修飾的c-Myc mRNA CRD的結(jié)合（圖a-c）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，G19A突變體沒有增加內(nèi)源性IGF2BP1與m6A甲基化的c-Myc mRNA CRD的結(jié)合，這些結(jié)果表明：RBRP通過(guò)其G19殘基增加IGF2BP1與m6A修飾的c-Myc mRNA CRD的結(jié)合（圖d-g）。同時(shí)RIP-qPCR實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)沉默m6A寫入蛋白METTL14的表達(dá)，細(xì)胞內(nèi)RNA m6A水平降低時(shí)，RBRP過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)的內(nèi)源性IGF2BP1與c-Myc mRNA CRD結(jié)合的增強(qiáng)顯著受損，說(shuō)明RBRP不會(huì)增加IGF2BP1對(duì)m6A修飾的c-Myc mRNA CRD突變體的識(shí)別（圖h-i）。所以，RBRP（不是LINC00266-1本身）增強(qiáng)了m6A的識(shí)別和m6A閱讀蛋白IGF2BP1在RNA上的結(jié)合。

研究者接下來(lái)通過(guò)比較c-Myc mRNA的穩(wěn)定性，再次排除LINC00266-1的干擾，證明是RBRP增加了c-Myc mRNA的穩(wěn)定性，以及c-Myc mRNA和蛋白水平（圖a-c）。IGF2BP1的干擾阻斷了RBRP過(guò)表達(dá)引起的c-Myc mRNA穩(wěn)定性增強(qiáng)（圖d）。敲低METTL14后發(fā)現(xiàn)，RBRP過(guò)表達(dá)對(duì)c-Myc mRNA穩(wěn)定性的增強(qiáng)作用被消除，而c-Myc mRNA CRD突變顯著消除RBRP過(guò)表達(dá)引起的c-Myc mRNA穩(wěn)定性增強(qiáng)和c-Myc mRNA和蛋白水平升高。這些結(jié)果表明RBRP以c-Myc mRNA CRD m6A依賴的方式增加c-Myc mRNA的穩(wěn)定性（圖e-h）。隨后又通過(guò)對(duì)臨床樣本的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)c-Myc水平與RBRP 致癌肽水平呈正相關(guān)（圖i-j）。綜上研究說(shuō)明，RBRP通過(guò)加強(qiáng)IGF2BP1對(duì)c-Myc mRNA CRD的m6A識(shí)別，從而提高c-Myc mRNA的穩(wěn)定性。

結(jié)果

研究者發(fā)現(xiàn)LncRNA LINC00266-1實(shí)際上編碼了一種未標(biāo)記的肽（RBRP），該肽在腫瘤發(fā)生過(guò)程中具有致癌作用。接下來(lái)發(fā)現(xiàn)RBRP可以與m6A閱讀蛋白IGF2BP1結(jié)合使 mRNA 更加穩(wěn)定。最后發(fā)現(xiàn)通過(guò)RBRP與IGF2BP1的結(jié)合，增強(qiáng)IGF2BP1對(duì)RNA的識(shí)別作用，通過(guò)增加c-Myc mRNA的穩(wěn)定性和表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生。